研究背景股骨头坏死（Osteonecrosis of the femoral head,ONFH）已成为临床常见疾病,在中国,估计有8百万人正遭受着股骨头坏死疾病的折磨,尤其是激素性股骨头坏死在非创伤性因素当中占首位,青壮年多见,往往造成双侧的股骨头塌陷,功能丧失甚至残疾,严重降低了患者的生活质量。目前,国内外仍没有确切有效的策略预防激素性ONFH的发生,最终患者不得不求助于手术一髖关节置换术来治疗ONFH,这无疑给患者家庭增加了负担,而且不确定的远期疗效,更是给社会增加了负担。科学技术发展到今天,人们对激素性股骨头坏死发病机制的认识仍没有达成一致,因此,深入研究激素性ONFH的分子机制,探索激素性ONFH的靶向防治方法具有重要科学意义与应用前景。在生命科学领域,有着生命世界“暗物质”之称的非编码RNA,越来越多地被发现参与多种生物进化过程,如细胞周期调控、胚胎发育和细胞分化等。有研究报道,微小 RNA（microRNA,miRNA）和长链非编码 RNA（long non-coding RNA,lncRNA）在调控骨髓间充质干细胞（BMSCs）异常分化（成骨成脂分化）过程中起着非常重要的作用。BMSCs异常分化是ONFH发生起始过程中至关重要的环节,预防激素性ONFH,除抑制BMSCs成脂分化关键基因PPARy外,促进其成骨分化也是关键,尤其是对成骨关键基因Runx2的调控。我们知道,ONFH的发生是多基因、多因素共同作用的结果。不同的分子之间存在着网络式调控,比如一个lncRNA或miRNA可以调控多个靶基因,而多个lncRNA或miRNA又可以同时调控共同的靶基因,lncRNA与miRNA、或者lncRNA之间均可能存在相互的调控关系。目前,在国内外文献中尚未见到采用lncRNA-miRNA-mRNA多靶向网络式调控BMSCs的成脂与成骨分化预防激素性ONFH的研究报道。因此,本研究旨在通过构建lncRNA-miRNA-mRNA的多靶向、网络式调控方式探讨ONFH疾病的发生发展及其防治,具有重要的科学意义和价值。研究目的通过基因芯片和生物信息学分析筛选出激素诱导BMSCs与正常BMSCs差异表达的lncRNA和miRNA,验证目标lncRNA与miRNA1及miRNA2的相互结合作用,并验证GILZ是miRNA1的靶基因、Runx2是miRNA2的靶基因;通过上调目标lncRNA表达,下调miRNA1和miRNA2表达,进而上调靶基因GILZ表达、抑制PPARγ表达,同时上调Runx2基因表达,达到阻止细胞成脂分化同时主动促进成骨分化的双倍高效作用。本研究选取了股骨头坏死关系较为密切的 lncRNA TCONS-00041960、miR-204-5p 和 miR-125a-3p 进行研究,并探讨lncRNA-miRNA-mRNA的多靶向、网络式调控BMSCs的异常分化预防激性ONFH的优势及其机制。本研究分为以下五个部分:第一部分:激素诱导BMSCs特异表达的lncRNAs和miRNAs分析方法:（1）制备大鼠BMSCs:从大鼠的胫骨和股骨提取原代BMSCs,体外培养至P3代,然后用流式细胞仪行表面抗原CD29、CD34、CD45和CD105进行鉴定。（2）激素诱导BMSCs分化:用10₆M地塞米松诱导BMSCs;诱导第7天,用油红“O”进行染色确认激素诱导成功。（3）筛选激素诱导BMSCs特异表达的lncRNAs和miRNAs:采用基因芯片检测地塞米松诱导大鼠BMSCs与正常大鼠BMSCs内lncRNAs和miRNAs的表达差异;（4）基因芯片结果验证和靶基因表达检测:随机选取2个lncRNAs和4个miRNAs,采用qRT-PCR检测激素诱导大鼠BMSCs中目标lncRNAs和miRNAs的表达水平,以及PPARγ、Runx2和GILZ的mRNA表达水平。（5）采用SPSS 17.0软件对数据进行处理,进行统计学分析。结果:（1）流式细胞仪检测结果显示:P3代大鼠BMSCs表达CD29、CD105,阳性率分别为99.76%,99.42%;CD34、CD45呈阴性,阳性率分别为1.23%,1.41%,得到高纯度的BMSCs。（2）激素诱导BMSCs分化结果显示:用10₆M地塞米松诱导BMSCs 7天,油红“O”染色结果示:Model组中出现大量脂滴,Control组未出现脂滴,说明激素诱导细胞模型成功。（3）基因芯片检测结果显示:激素处理Model组与Control组对比,差异2倍以上的有10个miRNAs上调,16个miRNAs下调;79个lncRNAs上调,72 个 lncRNAs 下调。（4）qRT-PCR结果显示:激素处理Model组与Control组对比,lncRNA TCONS₀0041960的表达水平明显下调,差异具有统计学意义（P<0.01）,lncRNA TCONS₀0083120的表达水平明显上调,差异具有统计学意义（P<0.05）;miR-204-5p和miR-125a-3p的表达水平明显上调,差异具有统计学意义（P<0.05）,miR-146a-5p和miR-301a-3p的表达水平明显下调,差异具有统计学意义（P<0.05）;而且成脂基因PPARy表达水平升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,GILZ和Runx2基因表达水平下降,差异具有统计学意义（P<0.05）。第二部分:上调lncRNATCONS₀0041960对激素诱导的BMSCs分化的影响方法（1）构建过表达lncRNA TCONS₀0041960（Ex-Lnc）重组慢病毒和无关序列对照lncRNA TCONS₀0041960（Ex-NC）重组慢病毒,建立上调lncRNA TCONS₀0041960 的 BMSCs。（2）实验分四组:Blank组（空白组）、Dex组（激素诱导组）、Ex-Lnc+Dex组（激素诱导且过表达lncRNA TCONS₀0041960组）、Ex-NC+Dex组（激素诱导且过表达lncRNA TCONS₀0041960无关序列对照组）。（3）lncRNA TCONS₀0041960影响激素诱导的BMSCs分化:采用qRT-PCR 检测 Ex-Lnc+Dex 组和 Ex-NC+Dex 组中 lncRNA TCONS₀0041960 表达水平,确认感染是否成功;用10-6M地塞米松诱导Dex组、Ex-Lnc+Dex组和Ex-NC+Dex 组 BMSCs 14 天,分别采用 qRT-PCR 和 Western blot 检测大鼠BMSCs中成骨相关基因Runx2、Osterix和Osteocalcin的表达水平,以及成脂相关基因PPARγ、C/EBPα和GILZ的表达水平;同时检测细胞内甘油三酯含量（TG）和碱性磷酸酶（ALP）活性,并进行油红“O”染色。（4）采用SPSS 17.0软件对数据进行处理,进行统计学分析。结果（1）成功构建过表达lncRNA TCONS₀0041960（Ex-Lnc）重组慢病毒和无关序列对照lncRNA TCONS₀0041960（Ex-NC）重组慢病毒,慢病毒滴度分别为 1×108TU/ml 和 5×108TU/ml,成功建立上调的 lncRNA TCONS₀0041960的 BMSCs,感染系数（Multiplicity of infection,MOI）=2。（2）对比Dex组（激素诱导组）和Ex-NC+Dex组（激素诱导且过表达lncRNA TCONS₀0041960无关序列对照组）,Ex-Lnc+Dex组（激素诱导且过表达lncRNA TCONS₀0041960组）中的lncRNA TCONS₀0041960表达水平显著升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。提示慢病毒感染成功。（3）Ex-Lnc+Dex 组中,成骨相关基因 Runx2、Osterix 和 Osteocalcin 的基因表达水平和蛋白表达水平显著高于Dex组和Ex-NC+Dex组,差异具有统计学意义（P<0.05）;成脂相关基因PPARγ、C/EBPα的基因和蛋白表达水平显著低于Dex组和Ex-NC+Dex组,差异具有统计学意义（P<0.05）,而PPARγ抑制剂GILZ的基因和蛋白表达水平高于Dex组和Ex-NC+Dex组,差异具有统计学意义（P<0.05）。说明上调TCONS₀0041960可以抑制激素诱导大鼠BMSCs的成脂分化并促进成骨分化。（4）油红“O”染色中,可见Ex-Lnc+Dex组中的脂滴聚集明显少于Dex组和Ex-NC+Dex组,而且Ex-Lnc+Dex组中的甘油三酯（TG）含量也明显低于Dex组和Ex-NC+Dex组,差异具有统计学意义（P<0.05）;碱性磷酸酶活性（ALP）,Ex-Lnc+Dex组明显高于Dex组和Ex-NC+Dex组,差异具有统计学意义（P<0.05）。第三部分:下调miR-204-5p和miR-125a-3p对激素诱导的BMSCs分化的影响方法（1）合成 miR-204-5p Inhibitor 和 miR-125a-3p Inhibitor,miR-204-5p negative control和miR-125a-3p negative control,并采用脂质体转染法将其分别转入BMSCs 中。（2）实验分组:Blank组（空白组）、Dex组（激素诱导组）、NC+Dex组（激素诱导且无关序列对照组）、miR-204-5p Inhibitor+Dex组（激素诱导且转染 miR-204-5p Inhibitor）、miR-125a-3p Inhibitor +Dex 组（激素诱导且转染miR-125a-3p Inhibitor）。（3）miR-204-5p和miR-125a-3p影响激素诱导的BMSCs分化:采用qRT-PCR分别检测五组中miR-204-5p和miR-125a-3p表达水平,确认转染是否成功;用 10-6M 地塞米松诱导 Dex 组、NC+Dex 组、miR-204-5pInhibitor+Dex 组、miR-125a-3p Inhibitor+Dex 组 BMSCs 14 天,分别采用 qRT-PCR 和 Western blot检测大鼠BMSCs中成骨相关基因Runx2、Osterix和Osteocalcin的表达水平,成脂相关基因PPARγ、C/EBPα和GILZ的表达水平;同时检测细胞内甘油三酯含量和碱性磷酸酶（ALP）活性,并进行油红“O”染色。（4）采用SPSS 17.0软件对数据进行处理,进行统计学分析。结果（1）qRT-PCR 检测结果显示:miR-204-5p Inhibitor 组中的 miR-204-5p 表达水平显著低于Dex组和NC+Dex组,差异具有统计学意义（P<0.05）;miR-125a-3p Inhibitor 组中的 miR-125a-3p 表达水平显著低于 Dex 组和 NC+Dex组,差异具有统计学意义（P<0.05）,提示转染成功。（2）在 miR-204-5p Inhibitor 组中,成骨相关基因 Runx2、Osterix 和Osteocalcin的基因和蛋白表达水平显著高于Dex组和NC+Dex组,差异具有统计学意义（P<0.05）;在 miR-125a-3p Inhibitor 组中,成脂相关基因 PPARγ、C/EBPα的基因和蛋白表达水平显著低于Dex组和NC+Dex组,差异具有统计学意义（P<0.05）;而PPARγ抑制剂GILZ的基因和蛋白表达水平高于Dex组和NC+Dex组,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）油红“O”染色中,miR-125a-3pInhibitor组中的脂滴聚集明显少于Dex组和NC+Dex组,而且miR-125a-3p Inhibitor组中的甘油三酯（TG）含量也明显低于Dex组和NC+Dex组,差异具有统计学意义（P<0.05）;碱性磷酸酶活性（ALP）,miR-204-5p Inhibitor组明显高于Dex组和NC+Dex组,差异具有统计学意义（P<0.05）。第四部分:LncRNATCONS₀0041960通过双靶向调控miR-204-5p和miR-125a-3p抑制激素诱导大鼠BMSCs成脂分化同时促进成骨分化方法（1）实验分组:Blank组（空白组）、Dex组（激素诱导组）、Ex-Lnc+Dex组（激素诱导且过表达 lncRNA TCONS₀0041960 组）、miR-204-5p Inhibitor+Dex组（激素诱导且转染 miR-204-5p Inhibitor 组）、miR-125a-3p Inhibitor+Dex 组（激素诱导且转染miR-125a-3p Inhibitor组）,通过qRT-PCR分别检测各组中miR-204-5p和miR-125a-3p的表达水平,以及检测成骨相关基因Runx2、Osterix和Osteocalcin的表达水平,成脂相关基因PPARγ、C/EBPα和GILZ的表达水平。（2）合成miR-204-5pmimic和miR-125a-3pmimic,并采用脂质体转染法将其分别转入大鼠BMSCs中。（3）通过检测Blank组（空白组）、Dex组（激素诱导组）、Ex-Lnc+Dex组（激素诱导且过表达 lncRNA TCONS₀0041960 组）、miR-125a-3p mimic+Dex组（激素诱导且转染 miR-125a-3pmimic 组）、Ex-Lnc+miR-125a-3pmimic+Dex组（激素诱导且过表达 lncRNA TCONS₀041960 和转染 miR-125a-3p mimic）五组中的甘油三酯含量（TG）来研究lncRNATCONS₀0041960与miR-125a-3p的相互关系;通过检测Blank组（空白组）、Dex组（激素诱导组）、Ex-Lnc+Dex组（激素诱导且过表达 lncRNA TCONS₀0041960 组）、miR-204-5p mimic+Dex组（激素诱导且转染 miR-204-5p mimic 组）、Ex-Lnc+miR-204-5p mimic+Dex组（激素诱导且过表达lncRNA TCONS₀0041960和转染miR-204-5p mimic）五组中的碱性磷酸酶活性（ALP）来研究lncRNA TCONS-00041960和miR-204-5p的相互关系。结果（1）Ex-Lnc+Dex 组与 Dex 组相比,miR-204-5p 和 miR-125a-3p 的表达水平均降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。在Ex-Lnc+Dex组和miR-204-5p Inhibitor+Dex组中成骨相关基因Runx2、Osterix和Osteocalcin的表达水平均高于Dex组,差异具有统计学意义（P<0.05）;Ex-Lnc+Dex组和miR-125a-3p Inhibitor+Dex组与Dex组相比,成脂相关基因PPARγ、C/EBPα显著降低,GILZ明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示上调lncRNATCONS₀0041960与下调miR-204-5p和miR-125a-3p对激素诱导BMSCs异常分化作用一致。（2）qRT-PCR检测结果显示:miR-204-5p和miR-125a-3p表达水平显著高于Dex组和NC+Dex组,差异具有统计学意义（P<0.01）。提示miR-204-5p mimic和 miR-125a-3p mimic 转染成功。（3）大鼠BMSCs的碱性磷酸酶活性（ALP）结果显示:与Dex组相比,Ex-Lnc+Dex组中的碱性磷酸酶活性（ALP）升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;miR-204-5pmimic+Dex组中的碱性磷酸酶活性（ALP）下降,差异具有统计学意义（P<0.05）;但是在 Ex-Lnc+miR-204-5pmimc+Dex 组中,大鼠 BMSCs 的碱性磷酸酶活性（ALP）下降,差异具有统计学意义（P<0.05）,提示lncRNA TCONS₀0041960通过负调控miR-204-5p来影响大鼠BMSCs的成骨分化。甘油三酯含量（TG）结果显示:与Dex组相比,Ex-Lnc+Dex组中的甘油三酯含量（TG）下降,差异具有统计学意义（P<0.05）;miR-125a-3pmimic+Dex组中的甘油三酯含量（TG）升高,差异具有统计学意义（P<0.05）;但是Ex-Lnc+miR-125a-3pmimic+Dex组中的甘油三酯含量（TG）升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,提示 lncRNATCONS₀0041960 通过负调控 miR-125a-3p来影响大鼠BMSCs的成脂分化。第五部分:LncRNA TCONS₀0041960通过双靶向调控miR-204-5p和miR-125a-3p抑制激素诱导大鼠BMSCs成脂分化同时促进成骨分化机制的初步研究方法（1）应用TargetScan与miRanda网站进行生物信息学分析,预测lncRNA TCONS₀0041960 潜在相互作用的 miRNAs,以及 miR-204-5p 和 miR-125a-3p的靶基因。（2）构建lncRNA TCONS₀0041960野生型荧光素酶双报告载体（pmirGLO-TCONS₀0041960-WT）和Seed Region突变型荧光素酶双报告载体（pmirGLO-TCONS₀0041960-MUT）,分别与 miR-204-5pmimic 和 miR-204-5p NC 共转染入 HEK 293T 细胞,与 miR-125a-3p mimic 和 miR-125a-3p NC 共转染入HEK 293T细胞,通过双荧光素酶报告证实TCONS₀0041960与miR-204-5p或与miR-125a-3p存在相互作用。（3）通过免疫共沉淀技术（RNA immunoprecipitation,RIP）,处理 BMSCs,利用A/G磁珠,形成与目的抗体Ago2结合的RNA复合物免疫共沉淀（实验组）和阴性对照抗体IgG结合的RNA复合物免疫共沉淀（对照组）,进一步分离含有目标 lncRNA TCONS₀0041960、miR-204-5p 和 miR-125a-3p 的 RNA 复合物,纯化RNA后,通过采用qRT-PCR检测RNA复合物中lncRNA TCONS₀0041960、miR-204-5p和miR-125a-3p在实验组和对照组中的表达水平,证实TCONS₀0041960 与 miR-204-5p 或与 miR-125a-3p 存在相互作用。（4）制备分别载有 TCONS₀0041960-WT 和 TCONS₀0041960-MUT 的生物传感芯片,通过表面等离子共振技术（surface plasmon resonance technology,SPR）,分别检测 TCONS₀0041960-WT 与 miR-204-5p mimic 和 miR-204-5p negative control 的反应值,TCONS₀0041960-WT 与 miR-125a-3p mimic 和miR-125a-3p negative control 的反应值;分别检测 TCONS₀0041960-MUT 与miR-204-5p mimic 和 miR-204-5p negative control 的反应值,TCONS₀0041960-MUT 与 miR-125a-3p mimic 和 miR-125a-3p negative control 的反应值,证实TCONS₀0041960 与 miR-204-5p 或与 miR-125a-3p 存在相互作用。（5）大鼠 BMSCs 中,研究 miRNAs（miR-204-5p 或 miR-125a-3p）对 lncRNA TCONS₀0041960 的影响:实验分五组:miR-NC 组（miRNA negative control）,miR-204-5p mimic组（转染miR-204-5p mimic）,miR-125a-3p mic组（转染miR-125a-3p mimic）,miR-204-5p Inhibitor 组（转染 miR-204-5p Inhibitor）,miR-125a-3p Inhibitor 组（转染 miR-125a-3p Inhibitor）,通过 qRT-PCR 检测lncRNA TCONS₀0041960 的表达水平。（6）大鼠 BMSCs 中,研究 lncRNA TCONS₀0041960 对 miRNAs（miR-204-5p或miR-125a-3p）的影响:实验分四组:Ex-NC组（过表达lncRNA TCONS₀0041960无关序列对照组）、Ex-Lnc组（过表达lncRNA TCONS₀0041960 组）、si-NC 组（lncRNA TCONS₀0041960 抑制剂无关序列对照组）、si-Lnc 组（抑制 lncRNATCONS₀0041960 表达组）,通过 qRT-PCR分别检测miR-204-5p和miR-125a-3p的表达水平。（7）构建双报告基因重组载体pmirGLO-WT 3’UTR-Runx2和pmirGLO-MUT 3’UTR-Runx2,分别与 miR-204-5p mimic 和 miR-204-5pNC 共转染入HEK 293T细胞;构建双报告基因重组载体pmirGLO-WT 3’UTR-GILZ和pmirGLO-MUT 3’UTR-GILZ,分别与 miR-125a-3p mimic 和 miR-125a-3p NC 共转染入HEK 293T细胞。采用双荧光素酶报告证实Runx2是miR-204-5p的靶基因、GILZ是miR-125a-3p的靶基因。通过Western blot技术分别检测Runx2在转染 miR-204-5p mimic 和 GILZ 在转染 miR-125a-3p mimic 的大鼠 BMSCs 中的蛋白表达水平。结果（1）TargetScan与miRanda生物信息学分析结果显示lncRNA TCONS₀0041960 与 miR-204-5p 和 miR-125a-3p 存在特异结合位点;Runx2 是 miR-204-5p的潜在靶基因、GILZ是miR-125a-3p的潜在靶基因。（2）双荧光素酶报告结果显示lncRNA TCONS₀0041960与miR-204-5p和miR-125a-3p 存在相互作用;Runx2 是 miR-204-5p 的靶基因,GILZ 是 miR-125a-3p的靶基因。（3）RNA 免疫共沉淀实验结果显示 lncRNATCONS₀0041960、miR-204-5p和miR-125a-3p在实验组Ago2抗体复合物中的表达水平明显高于对照组IgG抗体复合物中的表达水平,差异具有统计学意义（P<0.01）。（4）表面等离子共振实验结果显示TCONS₀0041960-WT与miR-204-5p mimic 反应值明显高于 TCONS₀0041960-WT 与 miR-204-5p negative control、TCONS₀0041960-MUT 于 miR-204-5p mimic、TCONS₀0041960-MUT 与miR-204-5p negative control 的反应值;TCONS₀0041960-WT 与 miR-125a-3p mimic 反应值明显高于 TCONS₀0041960-WT 与 miR-125a-3p negative control、TCONS₀0041960-MUT 与 miR-125a-3p mimic、TCONS₀0041960-MUT 与miR-125a-3p negative control 的反应值;说明 lncRNA TCONS₀0041960 与miR-204-5p 和 miR-125a-3p 存在相互作用。（5）与 miR-NC 组相比,miR-204-5p mimic 组和 miR-125a-3p mimic 组中的lncRNATCONS₀0041960表达水平下降,差异具有统计学意义（P<0.05）,miR-204-5p Inhibitor 组和 miR-125a-3p Inhibitor 组中 lncRNA TCONS₀0041960表达水平升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,说明miRNAs（miR-204-5p或 miR-125a-3p）对 lncRNA TCONS₀0041960 有调控作用。（6）Ex-Lnc 组与 Ex-NC 组相比,miR-204-5p 和 miR-125a-3p 的表达水平下降,差异具有统计学意义（P<0.01）;si-Lnc组与si-NC组相比,miR-204-5p和miR-125a-3p的表达水平上调,差异具有统计学意义（P<0.05）。说明lncRNA TCONS₀0041960 能够影响 miRNAs（miR-204-5p 或 miR-125a-3p）的表达水平。（7）Westernblot结果显示与空白组和转染miRNC相比,转染miR-204-5p mimic的Runx2蛋白表达水平下降,转染miR-125a-3p mimic的GILZ蛋白表达水平下降。说明miR-204-5p可以调控Runx2的蛋白表达水平,miR-125a-3p可以调控GILZ的蛋白表达水平。结论1.激素诱导的大鼠BMSCs成脂分化中,差异表达2倍以上有10个miRNAs上调,16 个 miRNAs 下调;79 个 lncRNAs 上调,72 个 lncRNAs 下调。lncRNA TCONS₀0041960 显著低表达,miR-204-5p 和 miR-125a-3p 显著高表达。2.上调 lncRNA TCONS₀0041960 的表达以及下调 miR-204-5p 和miR-125a-3p的表达可以有效抑制激素诱导的大鼠BMSCs的成脂分化,同时促进成骨分化。3.LncRNA TCONS₀0041960 通过负调控 miR-204-5p 调控 Runx2 的表达,负调控miR-125a-3p调控GILZ的表达,进而达到阻止大鼠BMSCs成脂分化同时主动促进成骨分化的作用。4.LncRNA-miRNA-mRNA多靶向网络式调控大鼠BMSCs的异常分化,有望成为研究防治ONFH新靶点。