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目的:1.研究Aβ处理对星形胶质细胞溶酶体的p H、体积及数目的变化,阐明Aβ对星形胶质细胞溶酶体功能的影响。2.用bafilomycin A1抑制质子泵,观察溶酶体pH、数目变化及溶酶体对外源性Aβ降解的影响。3.研究用NH4Cl处理星形胶质细胞后观察其对外源性Aβ降解的影响。4.研究forskolin对星形胶质细胞溶酶体的p H、体积及数目的变化,明确forskolin对星形胶质细胞溶酶体功能的影响。5.阐明forskolin处理对溶酶体降解Aβ的影响。6.研究forskolin处理对细胞内总Aβ含量的影响,阐明forskolin对星形胶质细胞Aβ含量的影响。方法:取新生1~3天小鼠的大脑皮层,进行原代星形胶质细胞培养。纯化后用胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)的单克隆抗体标记细胞骨架,鉴定培养的细胞为星形胶质细胞。将活细胞用DND-99标记以便于动态观察溶酶体变化。用200 nM的Aβ42孵育细胞30 min后,给予细胞250 nM的bafilomycin A1处理30 min(或用200μM的forskolin处理45 min),1μM的DND-99孵育30 min,活细胞成像观察溶酶体的p H、体积及数目的变化。用200 nM带绿色荧光标记的Aβ42孵育细胞30 min后,分别给予250 nM的bafilomycin A1和25mM的NH4Cl处理30 min(或用200μM的forskolin处理45 min),活细胞成像观察细胞内Aβ含量的影响。用200 nM的Aβ42孵育细胞30 min后,用200μM的forskolin处理45 min,裂解细胞并用ELISA方法检测内源性Aβ42的含量。结果:1.外源性Aβ42经星形胶质细胞内吞后定位到溶酶体。2.Aβ42处理使细胞溶酶体pH降低、溶酶体体积变大以及溶酶体数目减少。3.细胞经bafilomycin A1碱化以后,溶酶体数目减少;经bafilomycin A1处理以后,内吞的Aβ42在细胞内聚集。4.细胞经NH4Cl酸化以后,外源性Aβ42在细胞内的聚集减少。5.Forskolin处理使细胞溶酶体p H降低、溶酶体体积变大以及溶酶体数目减少;Forskolin处理使外源性Aβ42在细胞内聚集;Forskolin处理使内源性Aβ42的量增加。结论:Aβ处理星形胶质细胞30 min后定位到溶酶体。Aβ聚集在星形胶质细胞溶酶体中损伤溶酶体正常功能,导致溶酶体数目减少。Forskolin处理与Aβ处理产生类似的效果,并促使外源性Aβ在溶酶体中的积累,最终导致溶酶体数目的减少。Forskolin导致溶酶体功能损伤的机制可能与其激活PKA信号通路,促使内源性Aβ产生并积累到溶酶体有关。
