目的:1本研究依托COPD大鼠模型,通过对肺功能、肺组织病理HE染色和炎症评分及氧化酶指标的检测评估理肺汤的基本药效,重点关注氧化应激的应激酶水平的变化情况,表明理肺汤可以影响慢性阻塞性肺病症状和机体的氧化应激情况,整体调节慢性阻塞性肺病氧化/抗氧化失衡的机体状态。2采用分子生物学等多方法检测应激酶系统相关的MAPK/AP-1/y-GCS信号通路相关指标,揭示理肺汤通过MAPK/AP-1/y-GCS信号通路调控应激酶系统是抑制COPD氧化应激实现抗氧化的关键途径。方法:SPF级雄性SD大鼠70只,随机分为:正常组、模型组、地塞米松组、中药高、中、低剂量组和阻断剂组,每10只。建立慢性阻塞肺疾病大鼠模型。给药结束后,制备各实验组大鼠的肺组织、肺组织匀浆、支气管肺泡灌洗液和动脉血标本。进行肺功能检测、肺组织损伤病理HE染色及炎症病理学评分。采用酶联免疫组织化学方法对氧化应激中应激酶系统相关抗氧化酶指标进行检测。主要对支气管细胞灌洗液、血清及肺组织中GST、CAT、SOD、GSH、总谷胱甘肽进行浓度测定。免疫组化、Western blot和RT-PCR测肺组织中MAPK信号通路指标及其磷酸化情况评价理肺汤对MAPK信号通路的作用;采用免疫组化,Western blot和RT-PCR方法检测AP-1和y-GCS蛋白和mRNA表达情况,探索理肺汤对大鼠氧化应激影响的机制。结果:1实验表明,通过烟熏、气管内注射脂多糖复合臭氧暴露的方法,能够成功构建慢性阻塞性肺病大鼠模型。熏烟后需要建模组的大鼠即出现了阵发的咳嗽、呼吸较快的症状表现,建模结束时出现喘息声音比较明显,呼气与吸气有些困难,喉间痰鸣,精神萎靡,拱背蜷缩,皮毛发黄等表现。正常组无阳性症状,大鼠呼吸规律,精神良好,毛色有光泽,行动敏捷;阻断剂组大鼠呼吸规律,精神可,毛色光泽;理肺汤组和地塞米松组大鼠皮毛黄涩无光泽,中药高剂量组和地塞米松组症状缓解明显。2理肺汤可以部分缓解慢性阻塞性肺病大鼠的肺功能和组织病理炎症损伤,改善气道和肺内炎症状态。肺功能检测可见,COPD模型组大鼠FEF25%、MMF较正常组降低,提示建模组的大鼠存在着小气道阻塞障碍的可能;模型组FVC、FEV1、FEV1/FVC%较正常低,表明模型组大鼠可能存在混合型通气障碍;各给药组的大鼠肺功能经过药物治疗以后临床表现上得到不同的程度的改善,高剂量组和地塞米松组治疗后的肺功能更接近于正常组,中剂量组次之,但仍优于模型组。阻断剂组各指标接近正常组。表明用药后COPD大鼠的通气障碍和气道阻塞的情况得到一定的缓解,但COPD气道重塑的表现一旦形成将不可改变。各组大鼠BALF炎性细胞计数能很好的评估理肺汤对COPD炎症状态的影响。与正常组比较,模型组BALF炎症细胞均升高。用药后,地塞米松组和理肺汤组中性粒细胞和吞噬细胞比例降低。地塞米松组改善BALF中炎症的能力优于理肺汤组。HE病理表明,理肺汤组、地塞米松组和阻断剂组可见支气管的管腔的狭小,最终甚至表现出闭塞,支气管的管壁比较厚,有不同程度的肺气肿形成;肺组织炎性细胞浸润,肺泡间隔增厚,肺泡壁变薄等病理表现,但病理损害程度得到不同程度的缓解。与模型组比较,地塞米松组支气管管腔基本正常,管腔未见明显增厚,管壁炎症较轻,肺泡间隔轻度增宽,小叶中心型和全小叶型肺气肿轻度形成,使用较大量的激素后常常导致部分大鼠有明显的弥漫性间质性肺炎的表现。理肺汤高中剂量效果比理肺汤低剂量效果好,高剂量组的气道炎症较轻,管腔狭窄不明显可见,支气管和血管平滑肌表现出轻度增生。组织损伤炎症病理学评分后,可见理肺汤组各剂量组间呈现量效关系,各项具体得分中,低剂量组得分基本与模型组相同或稍低,而中药高剂量组基本与地塞米松组相似。与肺组织病理HE染色结果基本一致。3理肺汤能够有效的增强机体中抗氧化酶的表达,缓解机体的过氧化状态。模型组GSH/GSSG的比值下降,表明机体存在氧化应激状态。用药后,地塞米松组和中药高、中剂量组能不同程度的改善氧化应激损伤状态;同时,药物能够有效的增强组织,血清中抗氧化酶的表达。GSH/GSSG的比值可反应COPD病理演变过程中氧化应激情况,本研究结果表明理肺汤组能够提高GSH/GSSG的比值并增高氧化酶活性,抑制了氧化应激对机体损害的水平。4MAPK/AP-1/γ-GCS信号通路是氧化应激影响COPD的病情发生发展的关键环节。为了探索理肺汤调控应激酶系统作用机制,采用不同方法对肺组织MAPK信号通路,AP-1的c-Jun与c-Fos核蛋白和mRNA及γ-GCS的含量进行了检测。结果可见,COPD中P38 MAPK、JNK和ERK磷酸化水平明显升高。理肺汤治疗后,有效抑制了P38 MAPK、ERK和JNK的磷酸化。结果表明,活性氧的刺激显著上调MAPK信号通路的磷酸化水平。理肺汤治疗后可下调P38MAPK、ERK、JNK的活化。中药高剂量组大鼠肺组织中c-Jun与c-Fos核蛋白含量和mRN A水平与地塞米松组相比差异不明显。表明组方"理肺汤"可能通过对MAPK信号通路的磷酸化水平的影响,下调了AP-1蛋白及mRNA的表达,进而改善COPD的氧化应激状态,而达到一定的治疗作用。中药高剂量组大鼠肺组织γ-GCS-h核蛋白含量与地塞米松组相比差异不显著,表明理肺汤可以缓解机体的氧化应激状态,γ-GCS-h蛋白和mRNA表达较低,表明机体维持了一种氧化和抗氧化平衡状态。结论:1本实验成功的建立慢性阻塞性肺病大鼠模型。2 PD98059可以阻断COPD大鼠肺组织MAPK-ERK1/2信号通路。3 MAPK/AP-1/γ-GCS是氧化应激作用影响COPD的病情发生发展的关键环节4理肺汤对COPD大鼠治疗显著有效,其机制涉及对应激酶系统的调节作用。5理肺汤可以通过抑制MAPK信号通路磷酸化水平,下调AP-1蛋白和mRNA的表达,进而影响γ-GCS蛋白和mRNA的表达,达到治疗作用。但MAPK/AP-1/γ-GCS的信号传导是十分精细而又复杂的过程,理肺汤的作用靶点尚不能十分明确,其疗效机制的完善仍需要更深入的研究。