紫茎泽兰（Eupatorium asenophorum Spreng.）是菊科泽兰属多年生草本植物,目前已在西南地区的云南、贵州、四川、广西、西藏等5省区广泛分布。近10年来,其入侵区域向东北方向蔓延扩散到重庆和湖北,防治形势日益严峻。紫茎泽兰长期对热带及南亚热带原产地气候条件的适应,能否逾越向北扩散过程中的低温限制实际上成为了它能否继续向北蔓延的关键之所在。本文以紫茎泽兰为研究对象,通过组织培养的方法获得大量的植物材料,进一步采用生理生化技术比较不同地理种群在低温胁迫下的生理响应,发现该物种在入侵我国的过程中已经自然形成了耐低温种群的低温生理适应性分化,为了明确这种分化的程度和分化机制（即紫茎泽兰的低温生理分化是否是种群间遗传结构和遗传变异而导致的不同生理表现,还是仅仅局限于种群间对低温环境的生理响应差异）,我们以高等植物中保守的低温关键转录因子CBF/DREB1基因为切入点,在克隆EaCBF1和其下游EaCOR基因的基础上,比较研究了紫茎泽兰不同耐低温种群间这两个基因的表达模式和造成表达差异的原因,并通过转基因技术验证EaCBF1的功能,以揭示EaCBF1在紫茎泽兰低温生理分化中的作用,进一步阐明该物种的低温分子生态适应机制,有针对性地控制其继续蔓延扩散提供实验依据。本研究的主要结果如下:1紫茎泽兰组织培养研究1.1紫茎泽兰无性繁殖体系的建立MS+2.0 mg·L^-1 6-BA+0.05 mg·L^-1 NAA为丛生芽增殖的适宜培养基,而1/2 MS（大量元素减半）+0.1 mg·L^-1 IAA对生根比较有利。1.2紫茎泽兰离体再生体系的建立MS+0.1 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1NAA和MS+2.0 mg·L^-1 6-BA+0.2 mg·L^-1NAA分别适于叶片愈伤组织的诱导和分化,而0.7%琼脂+3%蔗糖为愈伤组织形成的支持物和C源的最佳配比。1.3紫茎泽兰不同地理种群组织培养特性比较对9个紫茎泽兰地理种群的组织培养特性进行比较的结果表明:它们的丛生芽月增殖系数之间存在显著差异（3.65-7.60）;贵州黄果树种群叶片愈伤组织诱导率最高;而各种群叶片愈伤组织的再分化能力与单块愈伤组织诱导芽的能力相一致;但是不同种群的生根能力无显著差异。2紫茎泽兰低温生理响应2.1紫茎泽兰不同地理种群耐低温能力的比较依据紫茎泽兰在-5℃间歇低温胁迫下的低温害症状,提出其低温伤害分级标准,并通过计算低温伤害指数和低温半致死温度来比较不同地理种群的耐低温能力。结果表明:紫茎泽兰低温半致死温度与-5℃处理4d后的低温伤害指数两者呈正相关,广西百色种群低温伤害指数和低温半致死温度均为最高,属于低温敏感种群,而贵州黄果树这两项指标都为最低,属于耐低温种群。2.2紫茎泽兰不同地理种群对低温胁迫的生理反应比较紫茎泽兰9个不同耐低温地理种群在-5℃间歇低温胁迫过程中叶片生理变化的结果表明:随着胁迫时间的延长,丙二醛和可溶性蛋白质含量持续上升,可溶性糖含量、叶绿素含量和光合作用羧化效率保持下降,超氧化物歧化酶活性先下降,后缓慢上升最后又下降;-5℃处理4d后,广西百色种群丙二醛含量增加24.94倍,贵州黄果树种群可溶性蛋白质含量最高,广西百色种群SOD活性下降了35.68%而贵州黄果树种群仍保持为处理前的69.60%,然而,贵州黄果树种群可溶性糖含量、叶绿素含量和光合作用羧化效率比广西百色种群少下降58%、44%和32%;低温伤害指数分别与叶绿素含量和光合作用羧化效率呈负相关,相关系数为-0.622和-0.619。3紫茎泽兰低温分子生态适应机制研究3.1紫茎泽兰低温调控关键转录因子EaCBF及其下游EaCOR基因、EaACTIN基因cDNA序列的克隆运用RACE方法从紫茎泽兰叶片中克隆得到3个基因的cDNA全长序列,分析它们的序列发现:EaCBF1所编码的氨基酸具备DREB类转录因子的3个特征结构域（碱性核定位区域、典型AP2结构域和酸性激活区域）,其分子量和等电点分别为24.56 KDa和4.87,与LeCBF3的同源性最高（63%）,属于DREB家族的A1亚群;EaCOR编码一个含有脱水特征结构域的高度亲水性多肽,分子量和等电点分别为28.72 KDa和4.66,EaCOR蛋白与油菜COR25、荠菜COR29的进化关系较近,而与咖啡CcDH3的同源性最高（61%）;EaACTIN编码一个由377个氨基酸组成的肌动蛋白,其分子量和等电点分别为41.75 KDa和5.16,EaACTIN与甜菊SrActin蛋白的进化关系最近,且它们的氨基酸序列间同源性最高（100%）。3.2紫茎泽兰低温调控关键转录因子EaCBF1及其下游EaCOR基因DNA序列的克隆运用长片段PCR和热不对称PCR方法从紫茎泽兰叶片中克隆得到EaCBF1、EaCOR的DNA序列和EaCBF1的侧翼序列,分析它们的序列发现:EaCBF1 DNA序列中没有内含子;EaCOR的DNA序列由2个外显子和1个内含子组成;通过3个单独的Tail-PCR扩增获得EaCBF1基因1020 bp 5’侧翼序列和706 bp 3’侧翼序列,该基因的5’侧翼序列含有TATA box（-69～-66 bp）、G-box（-116～-110 bp）、2个MYC识别位点（-135～-129 bp和-108～-103 bp）和2个MYB识别位点（-259～-255 bp和-282～-287bp）。3.3紫茎泽兰不同耐低温种群EaCBF1基因表达情况比较利用半定量RT-PCR和Northern杂交方法分析4℃处理条件下紫茎泽兰不同耐低温种群营养器官中EaCBF1基因表达情况,结果表明:在未处理前,EaCBF1基因在紫茎泽兰叶片、茎和根中并无表达,4℃处理0.5 h后,该基因开始表达,并随着处理时间的延长,表达量持续增加,即EaCBF1基因为低温诱导型基因;它的表达丰度与紫茎泽兰耐低温能力密切相关,低温处理不同时间后,耐低温种群营养器官中EaCBF1基因的表达量都大于低温敏感种群中的表达;4℃处理24 h后,EaCBF1mRNA的转录水平在耐低温种群贵州黄果树中最高,而它在低温敏感种群广西百色中最低,叶片、茎和根中的表达量分别为贵州黄果树的56%、63.7%和90.3%;EaCBF1基因在同一种群不同营养器官中的表达也存在差异,4℃处理不同时间后,该基因的表达量均为:叶片＞茎＞根。进一步分析发现不同种群中该基因均以单拷贝的形式存在,但是它们在染色体上的位置有所差异（杂交条带位置不同）,推测这是造成EaCBF1基因在不同种群中表达差异的原因。3.4紫茎泽兰不同耐低温种群EaCOR基因表达情况比较利用半定量RT-PCR和Northern杂交方法分析4℃处理条件下紫茎泽兰不同耐低温种群营养器官中EaCOR基因表达情况,结果表明:在未处理前,EaCOR基因在紫茎泽兰叶片、茎和根中并无表达,4℃处理1 h后,该基因开始表达,并随着处理时间的延长,表达量持续增加,即EaCOR基因为低温诱导型基因;它的表达丰度与紫茎泽兰耐低温能力密切相关,低温处理不同时间后,耐低温种群营养器官中EaCOR基因的表达量都大于低温敏感种群中的表达;4℃处理24 h后,EaCOR mRNA的转录水平在耐低温种群贵州黄果树中最高,而它在低温敏感种群广西百色中最低,叶片、茎和根中的表达量分别为贵州黄果树的66%、56.4%和89%;EaCBF1基因在同一种群不同营养器官中的表达也存在差异,4℃处理不同时间后,该基因的表达量均为:叶片＞茎＞根。进一步分析发现低温处理后,紫茎泽兰叶片、茎和根中EaCOR基因的表达滞后于EaCBF1基因,即EaCOR为EaCBF1的下游基因;在不同种群间,EaCBF1和EaCOR基因的表达变化趋势一致,这表明紫茎泽兰种群耐低温生理分化是由于EaCBF1基因表达调控的EaCOR基因在不同种群中表达差异造成的。3.5 EaCBF1基因的功能验证通过在EaCBF1基因两端引入BamHI酶切位点,将目的基因连接进入真核表达载体pBI121,利用冻融法将pBI121-CBF的质粒转化进入根癌农杆菌,获得含有EaCBF1基因的根癌农杆菌GV-CBF。紫茎泽兰转基因过程中根癌农杆菌最佳浸染条件为:Kan 50 mg·L^-1为抗生素筛选选择压;预培养3 d,根癌农杆菌GV-CBF悬浮液浸染5 min;在该条件下,紫茎泽兰的转化率为4.4%;在GUS染色呈阳性的23株抗性苗中有2株（TG-1和TG-2）的耐低温能力得到增强,Southern杂交发现TG-1和TG-2都转化得到了EaCBF1基因的1个拷贝,而Northern杂交表明TG-1和TG-2中EaCBF1基因在常温下就能表达,4℃处理后,它们的EaCBF1基因的表达比未转基因对照（BSG）更强烈。