一、研究背景和目的登革病毒是黄病毒科黄病毒属的单股正链RNA病毒,由11kb的核酸编码衣壳蛋白C,前膜蛋白prM和包膜蛋白E等3种结构蛋白以及7种非结构蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B,和NS5)。登革病毒主要以埃及伊蚊以及同属伊蚊的白纹伊蚊为传播媒介。依据数学模型的估计,全球每年约有5000万感染病例发生,而在登革病毒流行的热带和亚热带地区,发生率正在逐年上升。感染登革病毒后可能表现为无症状或轻微的自限性的发热或登革热(DF),但也可以发展为严重的危及生命的疾病即登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)。登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)的主要症状是血管内血液的流失伴随着血细胞比容的上升、血压的下降和浆液性渗出,这些均为疾病发展进展过程中血管内皮损伤导致。登革病毒曾经被视为一种非神经毒性病毒。由于因登革病毒引起神经系统症状的病例较少,这在一定程度上限制了登革病毒在神经病学方向的发展。1976年,Sanguansermsri等首次将不同寻常的神经系统表现和登革病毒感染联系在了一起。从那以后,在登革病毒感染发生病例中,描述与神经系统症状相关症状的报告逐渐增多。虽然各种神经系统并发症的确切发病率仍然不清楚,但是登革病毒感染时最常见的神经系统并发症——脑病和脑炎的发病率则介于0.5%至6.2%之间。然而,在死于登革病毒感染的人群中,这个比例明显高于那些从登革病毒感染中恢复的人群。巴西东北部Ceara’州的流行区域内,在致命性登革病毒感染人群中,中枢神经系统感染症状的发生率甚至高达48.8%。同时,最近的众多观察数据也表明,登革病毒感染的临床表现正在发生改变,神经系统表现的报道也更为频繁。登革病毒感染引起的神经系统症状曾经被认为是由血液的外渗、脑水肿、低钠血症、肝或肾功能衰竭而引起的脑病,而不是由于登革病毒侵犯局部中枢神经系统而导致的脑炎。然而,一例儿童尸检的组织学检查中找到了登革病毒抗原的报告,证明了登革病毒性脑炎的存在。同时,在登革病毒性脑炎患者的脑脊液(CSF)中分离出登革病毒,运用免疫组化,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等技术在下橄榄核以及小脑的颗粒层中检测到了登革病毒的存在,在神经元,小胶质细胞和内皮细胞中也观察到了登革病毒的免疫原性反应,这些均为登革病毒拥有神经毒性提供了强而有力的证据。众所周知,血脑屏障(BBB)是一个介于血液循环系统和脑组织之间的对物质通过有选择性阻碍作用的独特膜性结构,血脑屏障可以保护大脑免受有害物质的入侵。血脑屏障主要由三个功能性结构组成：(1)物理屏障,由细胞间的紧密连接组成(2)低效率内吞作用的细胞们本身(3)代谢屏障,主要由内皮细胞表达的特定膜转运蛋白起作用。然而,即使有这个屏障,一些病毒如登革热病毒,西尼罗河病毒和东部马脑炎病毒仍然能够通过一些未知的机制进入中枢神经系统(CNS)。由于组成血脑屏障的细胞们直接暴露于外周血液系统中的游离病毒中,那么登革病毒在作为血脑屏障细胞重要组成的人脑微血管内皮细胞中感染和复制,可能成为登革病毒进入中枢神经系统(CNS)的一个重要途径。病毒感染血脑屏障中的血管内皮细胞导致血脑屏障的性能改变的机制已经在几种病毒的感染机制中得以体现,特别是那些能够导致急性神经退行性疾病和神经炎症的病毒,比如猴免疫缺陷病毒(SIV)、麻疹病毒和人类T-淋巴细胞白血病病毒。此外,游离的登革病毒也可以在不改变血的脑屏障完整性的情况下通过转吞胞作用机制通过血脑屏障。或者,通过调节紧密连接蛋白的表达从而允许游离的病毒以及病毒感染后的细胞得以进入中枢神经系统。例如,艾滋病毒和猴免疫缺陷病毒感染中枢神经系统时即能够诱导脑微血管细胞的紧密连接蛋白(TJP)和细胞粘附分子(CAM)的表达发生改变,导致带有高病毒载量的被感染炎症细胞以“特洛伊木马”的形式进入中枢神经系统。此外,动物研究已经表明,登革病毒感染时能够使得IFN-γ、IL-6和MCP-1等细胞因子释放增加,导致登革病毒更容易突破血脑屏障进入中枢神经系统。因此,本研究则以描述登革病毒感染人脑微血管内皮细胞为特点,重点研究其感染对紧密连接蛋白(TJP)和粘附蛋白(CAM)的表达。同时,被感染细胞上清的中的细胞因子的变化也是重点监测对象。二、研究方法1.登革3型病毒感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)的感染动力学研究冰上仔细研磨实验室储存的登革3型乳鼠鼠脑,获取病毒原液后感染单层C6/36细胞,置于28℃二氧化碳培养箱中培养,逐日观测细胞,待约超过80%细胞出现CPE时,收集细胞及上清,以获取病毒富集液；采用TCID50的方法对富集的病毒液进行毒力滴定后,以感染复数(MOI)为5的病毒量感染HBMEC,于24h,48h,72h,96h观测HBMEC的CPE现象；收集该时间点感染后的细胞上清,采用Taqman探针法RT-PCR的方法,检测其中病毒拷贝数的变化以确定登革3型病毒能否感染HBMEC并能在其中进行复制；采用免疫荧光检测技术,检测以上时间点的细胞中登革3型病毒非结构蛋白NS1的表达变化情况,以进一步确定登革3型病毒感染HBMEC的感染方式。2.登革3型病毒感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)对血脑屏障中紧密连接的影响采用Primer5.0以及Oligo7.0设计与评估人血脑屏障紧密连接相关的蛋白基因ZO-1,Claudin-1, Occludin-1的上下游引物；收集MOI为5的登革3型病毒感染后不同时间点的HBMEC细胞,采用RNA提取试剂盒提取不同时间点细胞的mRNA,然后采用SYBG染料法的RT-QPCR检测这些紧密连接相关基因在感染后不同时间点的变化；收集MOI为5的登革3型病毒感染后不同时间点的HBMEC细胞,采用RIPA裂解液裂解后获取细胞蛋白,采用Western-blot技术,检测细胞中紧密连接相关蛋白在感染后的变化趋势,以评估登革3型病毒感染HBMEC后对血脑屏障紧密连接产生的影响。3.登革3型病毒感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)后对白细胞粘附的影响。采用Primer5.0以及Oligo7.0设计与评估人血脑屏障中与白细胞粘附相关的蛋白基因RANTES, E-selectin, PEC AM, VCAM-1, ICAM-3的上下游引物；收集MOI为5的登革3型病毒感染后24h,48h,72h,96h不同时间点的HBMEC细胞,采用RNA提取试剂盒提取不同时间点细胞的mRNA,然后采用SYBG染料法的RT-QPCR检测这些与白细胞粘附相关基因在感染后不同时间点的变化；收集MOI为5的登革3型病毒感染后不同时间点的HBMEC细胞,采用RAIP裂解液裂解后获取细胞蛋白,采用Western-blot技术,检测在RT-QPCR中显示变化明显的白细胞粘附蛋白在感染后的变化趋势,以评估登革3型病毒感染HBMEC后对血脑屏障紧密连接产生的影响。4.登革3型病毒感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)后上清中细胞因子的变化。收集MOI为5的DV3感染后24h,48h,72h不同时间点的HBMEC培养上清以及未感染时的细胞培养上清各2ml,采用基于夹心法ELISA原理的蛋白芯片检测这些时间点上细胞因子的变化趋势,对于蛋白芯片检测出有意义的细胞因子,采用western-blot方法对这些细胞因子进行进一步的确认。三、结果1.登革3型病毒感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)的感染动力学研究登革3型病毒能够感染HBMEC,并在其中复制。通过光学显微镜观察感染后HBMEC,可见随着感染时间的延长,HBMEC逐渐缩小,变圆,并从培养瓶上脱落漂浮于培养液中；而感染后的细胞上清中登革病毒拷贝数逐渐减小,及病毒滴度上升；感染后的HBMEC采用免疫荧光技术观察后可见细胞中NS1表达比例逐渐增加。2.登革3型病毒感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)对血脑屏障中紧密连接的影响采用QPCR检测与人血脑屏障紧密连接相关的蛋白基因ZO-1, Claudin-1, Occludin-1中, ZO-1, Claudin-1均于感染后24h后会应激性的增加mRNA的表达量,而后其表达量又会急速下降至正常或更低,随着感染时间的延长,逐渐恢复到正常水平。Western-blot进一步确认时,ZO-1, Occludin-1均在感染的第2天出现表达高峰,而后逐渐降低,到第四天最为明显。而Occludin-1的mRNA表达量微小的增加在WB分析中没有检测到有意义的变化。3.登革3型病毒感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)后对白细胞粘附的影响。采用QPCR检测与人血脑屏障细胞粘附相关的蛋白基因RANTES, E-selectin, PEC AM, VCAM-1, ICAM-3中, VCAM-1与RANTES均于感染后48h后明显的增加,VCAM-1最大高峰为感染后第二天,并持续高于对照组,RANTES较早时期与正常水平接近,最大高峰为感染后第三天。而在采用Western-blot进一步确认时,仅RANTES的蛋白表达量与QPCR结果一致,而VCAM-1的表达没有检测到有意义的变化。E-selectin, PECAM在感染后的mRNA及WB检测中均没有明显变化。4.登革3型病毒感染人脑微血管内皮细胞(HBMEC)后上清中细胞因子的变化。对于未感染组和感染后的24h,48h,72h的细胞培养上清,同时检测了常见的23种与白细胞趋化、炎症反应、抗病毒等密切相关的细胞因子,其中GM-CSF、IL-13、MCP-2、MIG、RANTES等在感染后24h,48h,72h的量超过对照组的1.5倍,IFN-7以及MCP-1同样有轻度的增加,对于这些因子是否有确切的意义需要进一步的western-blot检测。四、结论1.作为血脑屏障重要组成的HBMEC,在登革3型病毒感染HBMEC的感染动力学研究中,我们通过感染后的CPE现象,感染后细胞上清中病毒拷贝数qRT-PCR,感染后细胞中NS1的表达的免疫荧光检测,证实了登革3型能够感染HBMEC导致其产生CPE现象,同时能够在其中复制且能够将复制的子代病毒释放到培养的细胞上清中。这种感染方式和登革病毒的易感细胞如单核细胞及BHK-21类似能够持续在细胞中复制,并伴随着CPE。因此,可以猜测登革3型病毒能够直接感染HBMEC并释放病毒,这种细胞穿胞途径可能成为登革3型病毒跨越血脑屏障进入CNS的途径之一。2.在本研究中,登革3型病毒感染HBMEC后能够对血脑屏障中紧密连接的相关的基因如ZO-1以及Claudin-1在mRNA水平的表达呈现为感染首日应激性大幅度的增加,而在感染的随后几日中又会下降到正常水平或接近正常水平,在相应蛋白的WB检测中,ZO-1的表达同样在首日应激性增加后,随后感染的几日的表达相对未感染组下调,这可能是紧密连接蛋白对感染后细胞释放的细胞因子的一种应答表现。而ZO-1在连接跨膜蛋白与细胞骨架蛋白之间起着重要的中心作用,而随着感染时间的延长,其表达量的下降可能导致血脑屏障渗透性增加,使得登革3型病毒能够通过细胞旁途径进入CNS。3.被感染的单核巨噬等易感细胞能够以“特洛伊木马”的形式进入CNS,使得病毒更易在中枢神经系统细胞中扩散。而被感染的HBMEC能够导致白细胞粘附相关的蛋白(CAM)以及趋化其粘附的RANTES表达上调,这些蛋白能够促进被感染的单核巨噬细胞更容易进入CNS,这表明“特洛伊木马”机制可能是形成登革脑炎的一个重要原因。4.在登革3型病毒感染HBMEC后的细胞上清中,GM-CSF、IL-13、MCP-2、 MIG、RANTES等细胞因子的表达量出现超过1.5倍的上升,IFN-7以及MCP-1同样有轻度的增加。而在研究已经表明这些细胞因子主要与白细胞的趋化、生成及成熟均有密切的关系,而上清中RANTES与被感染的细胞中的表达趋势保持一致,这些都表明了登革3型病毒感染HBMEC时,能够形成局部的炎症反应,趋化白细胞的聚集以及作用。这些将在后续的研究中得到进一步的证实。