由苹果黑腐皮壳Valsa mali（Vm）引起的腐烂病（Apple Valsa canker）造成苹果树皮溃烂坏死、树势衰弱、果品下降,严重时导致树死园毁,是苹果生产中最具毁灭性的病害。近几十年来,尽管国内外在该病原生物学研究中取得了一系列进展,然而对于其关键致病因子仍缺乏深入认识。鉴于该病菌能够引起树皮腐烂坏死,推测毒素及毒素蛋白在其侵染过程中发挥关键作用。目前为止,国内外已从Vm中陆续分离、鉴定到一些小分子毒素物质,但尚无任何致病相关毒素蛋白的报道。Nep1（Necrosis and ethylene-inducing peptide 1）-Like Protein（NLP）是广泛存在于细菌、真菌和卵菌中的一类毒素蛋白,其能够诱导双子叶植物细胞坏死,是多种植物病原菌中的重要致病因子。为此,本研究对Vm的NLP蛋白进行了分析、鉴定,并对其生物学功能进行研究。获得的主要结果如下:（1）Vm编码两个NLP蛋白（Vm NLP1和Vm NLP2）,其中Vm NLP2能够诱导植物细胞坏死本研究以最早发现于尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）中的Fo Nep1为基本序列,利用BLAST＿P从Vm基因组中鉴定到两个NLP蛋白,分别命名为Vm NLP1和Vm NLP2。在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中瞬时表达发现,Vm NLP2能够诱发细胞坏死,而Vm NLP1不能诱导坏死。进一步经原核表达获得Vm NLP2纯化蛋白并滴加至苹果（Malus domestica）叶片发现,该蛋白也能诱导苹果细胞坏死。NLP蛋白存在高度保守的七肽基序（GHRHDWE）,然而Vm NLP2七肽基序中的第二个组氨酸突变为了酪氨酸（GHRYDWE）。将该酪氨酸替换为保守组氨酸(Vm NLP2Y137H)后,其在本氏烟上诱导的细胞坏死较Vm NLP2增强。以上结果表明Vm NLP2是一个具有诱导细胞坏死的毒素蛋白,且其七肽基序中酪氨酸位点影响毒素活性。（2）Vm NLP2是一个重要致病因子为明确Vm NLP1和Vm NLP2是否参与病菌致病,本研究利用PEG介导的遗传转化体系分别获得两个基因的敲除突变体并接种至苹果叶片和枝条进行致病力测定。结果发现,与野生型（WT）相比,Vm NLP1敲除突变体致病力无明显变化,而Vm NLP2敲除突变体ΔVm NLP2-36在苹果叶片和枝条上的致病力分别下降了约16%和27%。为探究Vm NLP2致病力与其诱导坏死活性的可能关系,将Vm NLP2Y137H点突变序列回补至ΔVm NLP2-36并进行致病力检测,发现该回补突变体在叶片上的致病力较Vm NLP2回补菌株增强约18%。该部分结果说明Vm NLP2是Vm的一个重要致病因子,且其坏死活性有利于病菌侵染致病。（3）Vm NLP1和Vm NLP2参与维持细胞膜稳定性及对盐和渗透胁迫的响应为进探究Vm NLP1和Vm NLP2是否参与Vm对非生物胁迫的响应,将其敲除突变体分别接种至含有不同抑制剂的PDA平板上并观察菌落生长情况。结果发现,与WT相比,Vm NLP1及Vm NLP2敲除突变体在含SDS、刚果红和山梨醇的平板上营养生长受到不同程度的抑制或促进作用,表明Vm NLP1和Vm NLP2在维持Vm细胞膜完整性,以及在病菌对盐胁迫和渗透胁迫的响应中发挥不同的作用。（4）Vm NLP2中的保守多肽能够被非寄主拟南芥识别研究表明,NLP蛋白中的保守多肽可被拟南芥（Arabidopsis thaliana）识别并激发免疫反应。为探究Vm NLP1和Vm NLP2中相应保守多肽是否具有免疫诱抗性,本研究合成获得多肽nlp20（Vm NLP1）和nlp25（Vm NLP2）。用1μM多肽处理拟南芥叶片并对免疫反应相关指标进行检测发现,只有nlp25（Vm NLP2）能显著激发活性氧迸发以及免疫标志基因（At PR1、At WRKY33、At FRK1）的上调表达,并显著诱导拟南芥对核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的抗性。然而,nlp25（Vm NLP2）不能诱导苹果活性氧迸发及免疫标志基因表达。该结果说明Vm NLP2中的保守多肽能够被拟南芥识别,但是不能被寄主苹果识别。综上所述,本研究从Vm中鉴定到Vm NLP1和Vm NLP2两个NLP蛋白,并揭示了Vm NLP2是一个毒素蛋白和腐烂病菌的重要致病因子。此外,分析了Vm NLP1和Vm NLP2调控腐烂病菌响应多种非生物胁迫的功能,探索到Vm NLP2保守多肽在拟南芥上的免疫诱抗功能。本研究为NLP蛋白功能多样性提供了证据,更重要的是,Vm NLP2作为一个重要致病因子可作为苹果树腐烂病防治中的一个潜在靶标,从而为靶向药剂的研发提供科学依据。