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【研究背景】在世界范围内,原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一,且约90%以上的原发性肝癌是肝细胞癌(HCC)。肝炎病毒感染、肝硬化、酗酒和黄曲霉毒素感染均是肝癌的主要发病因素。这些危险因素通过不同机制可诱发肝细胞损伤、炎症反应、肝硬化,最终导致肝癌。多数患者就诊晚,诊断的HCC往往伴随着炎症和肝硬化,从而失去根治性治疗的机会,且HCC易转移,故疗效很差,严重危害人类健康。因此,我们致力于寻找可以改善患者预后的新的肝癌标志物。由于mi RNAs在肿瘤组织和血浆、血清中较为稳定,所以mi RNAs对于HCC早期的诊断具有重要的价值。mi RNAs是一类长约18-25个核苷酸的非编码RNA,它通过与其靶m RNA的3′-UTR端结合,从而降解靶m RNA或抑制其翻译,参与基因的转录后调控。我们实验室前期做基因芯片,通过mi RNA表达谱发现,在肝癌细胞中,多种mi RNA表达上调,而mi R-29b-3p上调尤为显著,这一现象引起了我们极大的兴趣。最近的研究表明,mi R-29家族在肿瘤发生的多个步骤如肿瘤增殖,凋亡,迁移,侵袭过程中发挥重要作用。但mi R-29-3p是如何调节肝癌进展的并不是很清楚。我们前期通过生物信息学软件预测,结果显示,mi R-29b-3p与TET2有四个互相作用的位点,提示我们TET2可能是mi R-29b-3p的靶点。TET家族包括TET1,TET2,TET3三个成员,在DNA去甲基化过程中发挥重要的作用。大量的研究发现,TET2在血液系统恶性疾病和多种实体瘤中扮演抑癌基因的角色。在我们前期的研究中,采集了大量肝癌组织和癌旁组织的临床标本,通过免疫组化实验发现,与癌旁组织相比,TET2在肝癌组织中的表达显著下调。随后,我们在细胞水平也验证了这一点,与正常人肝上皮细胞HL-02和五种肝癌细胞中,通过q PCR、Western blot和细胞免疫组化检测TET2的表达,发现在转录水平和转录后水平,和正常肝上皮细胞HL-02相比,TET2在各种肝癌细胞中均是低表达的。但TET2在肝癌中异常表达的分子机制仍不是很清楚。那么TET2在肝癌中异常表达是否与mi R-29b-3p表达失调密切相关呢?TET2是否受mi R-29b-3p的调控?于是,带着这样的疑问,我们展开了以下的实验。本实验主要分析表达升高的mi R-29b-3p对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制。我提出以下假说:mi R-29b-3p在肝细胞癌中是否发挥促癌基因的作用?TET2异常表达是否与mi R-29b-3p表达失调紧密相关?TET2是否是mi R-29b-3p的下游靶基因?mi R-29b-3p是否通过靶向TET2从而促进肝细胞癌的进展?【研究方法】1.通过q PCR检测人正常肝上皮细胞HL-02细胞株和肝癌细胞(Hep G2细胞株、SMMC-7721细胞株、Hep3B细胞株、BEL-7404细胞株、QGY-7701细胞株)中mi R-29b-3p的表达。2.在肝癌Hep G2和SMMC-7721细胞株中分别抬高和敲低mi R-29b-3p的表达。通过慢病毒转染,建立mi R-29b-3p高表达以及低表达的稳定细胞株,并通过q PCR检测其转染效率。3.通过细胞行为学实验(平板克隆、软琼脂集落形成、MTT、transwell、细胞周期)检测mi R-29b-3p对Hep G2和SMMC7721细胞恶性生物学行为的影响。4.在体内实验中,通过构建裸鼠移植瘤模型检测mi R-29b-3p对肝癌细胞裸鼠成瘤能力的影响。5.在Hep G2细胞中敲低mi R-29b-3p的表达,同时,在HL-02细胞中抬高mi R-29b-3p的表达。通过RT-PCR和Western blot实验检测mi R-29b-3p对TET2的调节作用。通过免疫组化实验检测裸鼠肿瘤组织中TET2蛋白的表达。通过荧光素酶报告基因实验,对mi R-29b-3p靶点的预测进行验证。【实验研究结果】1.与人正常肝上皮细胞HL-02细胞株相比,肝癌细胞株中mi R-29b-3p均表达上调。2.通过慢病毒转染,在Hep G2和SMMC-7721细胞株中成功构建了高表达以及低表达mi R-29b-3p的稳定细胞株。3.平板克隆、软琼脂集落形成、transwell和MTT实验表明,mi R-29b-3p促进了肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭的恶性生物学行为。细胞周期实验表明,mi R-29b-3p对肝癌细胞的细胞周期并无明显的影响。4.裸鼠移植瘤实验结果显示,将稳定转染mi R-29b-3p mimics的Hep G2细胞注入裸鼠体内,裸鼠移植瘤的生长速度、体积和重量均高于对照组。将稳定转染mi R-29b-3p inhibitor的Hep G2细胞注入裸鼠体内,裸鼠移植瘤的生长速度、体积和重量均低于对照组。5.在蛋白水平,m RNA水平和组织水平均证明mi R-29b-3p负向调控TET2的表达。生物信息学预测结果显示,mi R-29b-3p与TET2有四个互相作用的位点,但荧光素酶报告基因实验显示,TET2不是mi R-29b-3p的直接靶基因,这其中可能存在其他中间调控机制,有待进一步研究。【结论】mi R-29b-3p通过负向调控TET2促进肝细胞癌的恶性进展