背景恶性肿瘤的发病率逐年上升,而晚期病人往往发生恶病质,严重威胁其生存质量。目前,就癌症恶病质,在国际上已达成共识,普遍认为恶病质为“一种以骨骼肌持续亏损为主要表现的多因素综合征,这种症状不能由传统的营养支持完全逆转,从而导致进一步的功能障碍”[1]。据统计,60%~80%的晚期癌症患者都患有恶病质,在胰腺导管腺癌中更为严重,达到80%以上,严重降低了癌症治疗的耐受性,生存质量以及生存期[2]。然而,恶病质的详细机制还不能得到充分的解释,为此,我们需要更有用的临床试验找出生物标志物以便进一步理解其致病机制。先前的研究表明,胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP2)作为循环系统胰岛素样生长因子结合蛋白家族中数量最多的结合蛋白,能够削弱胰岛素样生长因子-1的生物活性,且在胰腺导管腺癌中较对照组过表达4.8倍;另外,已有研究表明,其在肺癌和肝癌中可作为诊断生物标志物[3-5]。然而,在胰腺导管腺癌中,IGFBP2水平与恶病质之间明确的关系还没有完全的解释。因此,我们的课题拟进一步探讨在胰腺导管腺癌中血清IGFBP2水平与恶病质之间的关系以及可能的机制。方法1.分析胰腺导管腺癌患者血清IGFBP2的水平及与临床病理参数的关系。我们收集了98例已经明确诊断为胰腺导管腺癌的病人以及30例健康人的血清标本,采用酶联免疫吸附试验检测胰岛素样生长因子结合蛋白-2(IGFBP2)的水平。并将这98例病人按照首次入院信息以及国际公认的恶病质的诊断方法划分为恶病质组以及非恶病质组,观察血清IGFBP2水平与恶病质以及临床病理参数之间的关系。2.分析胰腺导管腺癌患者血清IGFBP2水平与肌肉消耗的关系。查看98例病人术前2周之内的第三腰椎骨骼肌的CT图像,计算骨骼肌指数(SMI)以及CT值(HU),并与血清IGFBP2水平进行统计学分析,观察血清IGFBP2水平是否与肌肉消耗相关,并分析血清IGFBP2水平与生存期以及前白蛋白、淋巴系数绝对值、C-反应蛋白之间的关系。3.分析胰腺导管腺癌患者血清IGFBP2水平与肿瘤组织IGFBP2表达之间的关系。我们进一步收集了98例已经明确胰腺导管腺癌的病人的肿瘤组织标本,对IGFBP2进行了免疫组化染色并对其进行了评分,之后进一步分析肿瘤组织中IGFBP2的表达与血清IGFBP2水平之间的关系。4.血清IGFBP2水平升高与肌肉消耗相关的验证实验及其机制的探讨。本研究利用胰腺癌鼠源Pan02细胞系构建了过表达IGFBP2(PLV-IGFBP2)以及干扰IGFBP2(PLKO-IGFBP2)的稳定转染细胞系,并进行了Western blot以及ELISA实验,验证构建的稳系所表达IGFBP2的水平。接下来,采用C57/BL雌性小黑鼠构建胰腺癌皮下成瘤动物模型,分为野生型Pan02组、PLV-IGFBP2及其对照组,PLKO-IGFBP2及其对照组。皮下接种肿瘤细胞一周后,每天测量肿瘤大小以及体重和进食量,三周后将小鼠断颈处死,摘眼球取血检测血清中IGFBP2的水平。采用Western blot的实验方法检测不同组别小鼠腓肠肌组织中的Atrogin-1、Mu RF1、AKT、p-AKT的蛋白水平,采用RT-PCR的实验方法检测不同组别小鼠腓肠肌组织中的Atrogin-1、Mu RF1的m RNA表达量。对小鼠腓肠肌组织标本进行HE染色并观察肌肉萎缩的情况。结果1.IGFBP2在胰腺导管腺癌病人血清中水平显著升高,并与恶病质具有一定相关性。通过对98例胰腺导管腺癌(PDAC)病人血清以及30例健康对照的血清IGFBP2水平的检测发现,胰腺癌病人的血清IGFBP2水平(415.5±139.4ng/m L)显著高于健康对照组(259.1±59.8 ng/m L,P<0.01)。我们进一步将98例PDAC病人按照目前国际公认的恶病质的评判标准划分成恶病质组(n=50)以及非恶病质组(n=48),进而比较两组之间IGFBP2水平的差异,发现恶病质组的病人血清IGFBP2水平(453.5±132.2 ng/m L)显著高于非恶病质组(371.3±138.9ng/m L,P<0.01)。为了进一步探讨IGFBP2在胰腺导管腺癌相关恶病质的发展过程中的作用,我们分析了血清IGFBP2的水平与临床病理参数之间的关系,发现血清IGFBP2的水平与性别(P=0.159)、年龄(P=0.551)、肿瘤大小(P=0.848)、TNM分期(P=0.23)以及G分级(P=0.096)不存在相关关系;然而,与恶病质确有十分显著的相关性,相关系数为0.429(P<0.001)。2.血清IGFBP2水平升高与肌肉消耗增加及不良预后相关。我们查看了98例PDAC病人术前两周左右的CT扫描图像,并计算了第三腰椎骨骼肌质量指数(SMI)以及CT值(HU),发现恶病质病人的SMI以及HU值显著低于非恶病质的病人,因此我们进一步将这98例PDAC病人的血清IGFBP2水平与患者的SMI及HU值做了相关性统计学分析,发现它们之间有着显著的相关性,与SMI的相关系数为0.6(P<0.001),与HU的相关系数为0.532(P<0.001)。我们还分析了这98例PDAC患者的生存时间与血清IGFBP2水平之间的关系,发现血清IGFBP2水平相对较高的患者的生存期显著低于血清IGFBP2水平相对较低的患者。3.血清IGFBP2水平与肿瘤组织IGFBP2表达显著相关。接下来我们用5-6周的C57/BL雌性小黑鼠建立胰腺癌皮下移植瘤小鼠模型5只,皮下注射胰腺癌鼠源Pan02细胞,另外随机选取5只野生型小黑鼠作为对照组,皮下种瘤3周后,将两组小鼠分别断颈处死后进行摘眼球取血。采用ELISA的实验方法检测血清中的IGFBP2水平,发现与98例PDAC患者的检测结果一致,皮下种植Pan02细胞的小鼠血清中IGFBP2水平显著高于其对照组,并出现了恶病质的症状。我们进一步分析血清IGFBP2水平的增加是否与肿瘤组织直接相关。因此,我们将98例PDAC患者的肿瘤组织标本进行IGFBP2的免疫组化染色,发现有55例样本呈现IGFBP2高表达,43例样本呈低表达,与血清IGFBP2水平的相关性系数为0.562(P<0.001)。4.血清IGFBP2水平升高可能通过IGF/AKT信号通路引起肌肉消耗。接下来,我们用Pan02细胞构建了IGFBP2的过表达以及干扰的稳系,采用ELISA及Western blot的实验手段验证其过表达及干扰效率后,构建小鼠皮下移植瘤模型,发现过表达IGFBP2一组的小鼠进食量以及体重显著低于其对照组小鼠,血清IGFBP2水平也明显升高,腓肠肌以及心肌HE染色发现萎缩严重,而在干扰IGFBP2组的小鼠中,以上各项结果相比较其对照组都得到了缓解。接着,我们分别用RT-PCR以及Western blot的实验方法探讨过表达IGFBP2、干扰IGFBP2小鼠及其对照组小鼠腓肠肌中的AKT、p AKT以及两种肌肉特异性泛素链接酶Atrogin-1、Mu RF1的RNA以及蛋白水平,发现在过表达IGFBP2组中p AKT的活性显著降低,Atrogin-1和Mu RF1的表达明显升高,而在干扰IGFBP2的小鼠中却得到了相反的结果。结论1.胰腺导管腺癌患者血清IGFBP2水平显著高于正常对照,且与恶病质高度相关。2.血清IGFBP2水平升高与肌肉萎缩及不良预后相关,与前白蛋白及C-反应蛋白也具有一定的相关性。3.在皮下移植胰腺癌鼠源Pan02细胞的小鼠模型中,血清IGFBP2水平相较健康对照组小鼠显著升高,并且出现恶病质的临床表现。血清IGFBP2水平与肿瘤组织IGFBP2表达高度相关。4.皮下移植过表达IGFBP2细胞的胰腺癌小鼠模型相比较其对照组小鼠出现恶病质的典型症状,且血清IGFBP2水平显著升高,腓肠肌中IGF/AKT信号减弱,Atrogin-1、Mu RF1表达水平升高,出现严重的肌肉消耗。因此,根据以上的实验结果,在胰腺癌中,血清IGFBP2水平升高与恶病质相关,并可引起严重的肌肉消耗。