前列腺癌是一种上皮性恶性肿瘤,发生在前列腺中,在美国和欧洲成年男性的恶性肿瘤中发病率最高,这也是发达国家男性癌症死亡的十分重要的原因之一。而随着人们生活条件逐渐改善,人均寿命不断延长和饮食结构发生的巨大变化,前列腺癌的发病率和死亡率在我国均有逐渐升高的趋势。前列腺癌治疗方式主要有:无治疗而随访、前列腺全部切除术、放射治疗和内分泌治疗等。然而,这些治疗方法不能抑制肿瘤转移,对患者的正常组织也有高毒性。因此,寻找治疗前列腺癌的有效药物是首要任务。此外,尽管在手术,化疗和药物治疗方面取得了巨大进步,但由于癌症复发和转移,其发病率仍在增加。因此,阐明前列腺癌发展过程的分子机制可能有助于诊断和治疗的研究。海藻酸钠寡糖(alginate oligosaccharide,AOS)是通过海藻酸钠酶水解获得的海洋植物寡糖,由古洛糖醛酸和甘露糖醛酸两种结构单元组成。目前已知的功效有抗炎、抗病毒、抗真菌、抗肿瘤作用,此外还具有降低血脂、增强机体抗氧化功能及免疫调节的作用。近年来,大量研究表明壳寡糖可以提高机体的免疫力,抑制各种肿瘤和癌细胞。但关于AOS抗肿瘤相关报道很少,尽管已有文献证明AOS能够诱导骨肉瘤细胞凋亡,但是AOS在前列腺癌细胞的生长和增殖过程中是否发挥作用还未见报道。唾液酸是9碳单糖的衍生物,在细胞识别,粘附和信号转导中具有重要作用。根据唾液酸与糖残基的连接方式可将其分为α2,3-SA、α2,6-SA及α2,8-SA三大类,尤其是α2,6和α2,3连接的唾液酰基转移酶(sialyltransferases,STs)表达的改变更是与肿瘤发生密切相关。唾液酸化修饰保护与其相关的糖蛋白和糖脂结构稳定细胞膜结构,并改善热稳定性。它还可以保护细胞和大分子免受酶及免疫系统的攻击,从而保护细胞。临床上,癌症患者预后不良通常与异常唾液酸化有关。唾液酸广泛分布于体内,介导或调节许多生理和病理过程,如发育,炎症,病原感染,肿瘤发展等,并且与人类健康和疾病密切相关。与正常组织相比较发现,肿瘤组织和肿瘤细胞的糖链结构发生显著变化。其中,特征性唾液酸表达的显著上调与恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移和预后不良等相关。基于底物特异性和催化合成而形成的糖苷键类型不同可以把唾液酰基转移酶进一步细分为4类:ST3Gal I~VI;ST6Gal I、II;ST6GalNAc I~Ⅵ以及ST8Sia I~VI。其中ST6Gal-1介导的α2,6唾液酸化在癌症的进展中非常重要。大量文献报道,在结肠癌,肝癌,乳腺癌,前列腺癌和宫颈癌中发现了ST6Gal-1的高表达,本课题组前期研究发现,ST6Gal-1在前列腺癌DU145和PC3细胞生长增殖,迁移,侵袭中发挥促癌作用。此外,发现AOS上调前列腺癌细胞表面α2,6-唾液酸的表达。由此我们推测AOS是否通过影响ST6Gal-1的表达从而引起唾液酸的改变进而对前列腺癌细胞产生抑制作用。研究目的:考察AOS对前列腺癌细胞DU145和PC3生长增殖的抑制作用;阐明AOS通过影响ST6Gal-1表达进而抑制前列腺癌细胞生长增殖的具体分子机制。方法:采用CCK8、细胞集落、划痕实验、Transwell等方法检测AOS处理后对前列腺癌细胞(DU145和PC3)恶性表型的影响;AV/PI凋亡检测AOS对前列腺癌细胞凋亡能力的影响;流式细胞仪器检测AOS对前列腺癌细胞周期的影响;利用qPCR和Western-blot等方法检测AOS处理前后ST6Gal-1在前列腺癌细胞中的表达差异情况;通过Western-blot方法检测AOS处理后前列腺癌细胞凋亡相关蛋白和Hippo信号通路相关蛋白表达情况;通过构建ST6Gal-1启动子截短体报告基因载体和双荧光素酶报告基因实验研究AOS对ST6Gal-1启动子转录活性的影响及确定核心功能区域;生物信息学预测与ST6Gal-1启动子区结合的转录因子;染色质免疫共沉淀(CHIP)进一步验证与ST6Gal-1启动子核心区域片段相互作用的转录因子;免疫共沉淀(Co-IP)和免疫荧光共定位验证与ST6Gal-1启动子相互作用的转录因子c-Jun和Hippo/YAP信号通路效应器YAP之间的蛋白互作关系;体内裸鼠成瘤实验验证AOS对前列腺癌细胞生长增殖能力的影响及其分子机制。结果:AOS处理后,前列腺癌细胞生长增殖,迁移和侵袭能力均减弱;流式细胞术检测发现DU145和PC3细胞中处理组早期凋亡率高于未处理组,且细胞周期阻滞在S期;经过AOS处理的前列腺癌细胞株中ST6Gal-1的表达量明显低于对照组;Western blot结果显示,给药处理组凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase 9和cleaved-PARP的剪切条带表达量较对照组明显增加,Bcl-2表达量较对照组明显减少;Western blot结果显示AOS能够激活Hippo信号通路,相关蛋白P-YAP、PMOB1、MOB1、LATS1、MST1、MST2、SAV1的蛋白表达量增加,而促癌蛋白YAP表达量与对照组相比减少;双荧光素酶报告基因检测实验表明AOS对ST6Gal-1启动子活性调控起抑制作用,且核心功能区域为-308bp~+1bp的截短片段;PROMO数据库预测到与ST6Gal-1启动子区域结合的转录因子为调控肿瘤细胞增殖、分化、凋亡与肿瘤发生发展的c-Jun;同时染色质免疫共沉淀(CHIP)进一步验证了c-Jun能够结合ST6Gal-1基因上游的-308bp~+1bp区域,且AOS能够降低转录因子c-Jun与启动子ST6Gal-1的相互结合;免疫共沉淀(Co-IP)、免疫荧光共定位结果显示转录因子c-Jun和转录共激活子YAP发生相互作用;体内实验结果显示,AOS处理组的小鼠成瘤能力下降且体内生长的肿瘤体积较小并影响Hippo信号通路蛋白的表达。结论:1.海藻酸钠寡糖(alginate oligosaccharide,AOS)可抑制前列腺癌细胞的生长、增殖、迁移和侵袭等细胞生物学行为,并呈浓度依赖性。2.AOS能够抑制ST6Gal-1基因的转录水平进而抑制前列腺癌细胞的α2,6-唾液酸表达。3.AOS可抑制转录因子c-Jun和转录共激活子YAP对ST6Gal-1基因启动子的调控作用从而抑制前列腺癌细胞的生长增殖能力。