第一部分含砷中药青黄散为主方案对骨髓增生异常综合征患者甲基化调控作用研究目的：检测MDS患者的甲基化状态,分析异常基因甲基化状态所涉及的通路,理解异常基因甲基化在MDS病理中的作用；检测青黄散为主方案治疗前后MDS患者甲基化状态的改变情况,分析改变的异常甲基化基因所涉及的功能通路,明确青黄散为主方案治疗MDS的机理。方法：采用甲基化基因芯片技术(Chip-on-chip)检测治疗前15例MDS患者骨髓DNA甲基化状况,同时检测28例健康中国汉族人骨髓DNA甲基化,比较MDS患者与正常对照组甲基化的异同；采用自身对照研究方法,观察经青黄散为主方案治疗的15例MDS患者前后基因甲基化改变情况,同时以正常对照组28例,分析治疗前后MDS异常基因甲基化的改变情况。差异甲基化基因通过采用Fisher精确检验和χ2检验获取。异常的差异甲基化基因采用采用Go-analysis及Pathway-analysis方法进行分析。结果：1MDS患者的异常高甲基化和低甲基化基因：与正常对照组比较,MDS患者存在7724个异常高甲基化基因,同时有32个低甲基化基因。基于Go与Pathway数据库,我们对正常对照组与治疗前MDS基因甲基化水平比达1.4倍以上的基因进行分析,Go分析发现,MDS患者涉及554个高甲基化基因,这些高甲基因共参与237类不同的生物学功能和通路,包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、细胞循环负调控、细胞循环捕获调控、Wnt受体信号通路、Toll样受体信号通路、凋亡信号通路、BMP信号通路等。涉及了25个低甲基化基因,这些低甲基化基因共参与75类不同的生物学功能和通路,包括转录调控、细胞增殖正调控、B细胞分化正调控、免疫相关的白细胞激活、Wnt信号通路、对Wnt信号通路监管的调控等。Pathway分析发现,MDS患者共有185个高甲基化基因,这些高甲基因共参与35个不同的生物学通路,包括肿瘤通路、Wnt受体信号通路、DNA复制、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等。共涉及了2个低甲基化基因,参与1个生物学通路。2含砷中药青黄散为主方案对MDS基因甲基化的作用2.115例MDS患者经含砷中药青黄散为主方案治疗前后的甲基化状态改变：相对于治疗前MDS患者,经治疗有11311个基因的甲基化水平下降,57个基因的甲基化水平上升。对治疗前后达1.5倍以上变化的高甲基化和低甲基化基因进行Go与KEGG数据库分析,Go分析共发现了1895个低甲基化基因,这些低甲基因共参与640类不同的生物学功能和通路,包括细胞循环、细胞增殖、细胞死亡、凋亡及细胞表面受体信号通路、Wnt受体信号通路、BMP信号通路、toll样受体信号通路、Notch信号正调控等。发现了13个高甲基化基因,这些高甲基化基因共参与49类不同的生物学功能和通路,包括信号转导调控、上皮细胞调节、UTP与CTP生物合成等。Pathway分析共涉及了861个低甲基化基因,这些低甲基因共参与125类不同的生物学功能和通路,包括癌症通路、MAPK信号通路、P23/AKT信号通路、NF-KB信号通路、Wnt信号通路、Toll样信号通路、P53信号通路等。发现了了2个上调甲基化基因,这2个高甲基化基因共参与2类不同的通路即嘌呤与嘧啶代谢通路。2.2与正常对照相比,青黄散为主治疗方案对MDS甲基化作用与正常对照相比,青黄散方案治疗后高甲基化基因数由治疗前的7724降为3467,低甲基化基因由治疗前的32个提高至107个。对治疗前后达1.4倍以上变化的高甲基化和低甲基化基因进行GO与Pathway分析,与正常对照相比,进行GO分析的基因由治疗前的579个(高甲基化基因554个,低价甲基化基因25个)降为117个,低甲基化基因消失；进行Pathway分析的基因由治疗前的187(高甲基化基因185个,低价甲基化基因2个)降为30个,2个低甲基化甲基化基因消失。结合GO分析,经过青黄散为主方案治疗后,涉及细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、细胞循环负调控、细胞循环捕获调控、Wnt受体信号通路、Toll样受体信号通路、凋亡信号通路、BMP信号通路等功能与通路的异常甲基化基因已消失。通过Pathway我们也发现经过青黄散为主方案治疗后,涉及肿瘤通路、Wnt受体信号通路、DNA复制、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路的异常甲基化基因均已消失。结论：MDS患者具有大量异常的高甲基化基因,同时还有部分异常的低甲基化基因,通过GO与Pathway分析得出这些异常的高甲基化基因与低甲基化基因涉及多个肿瘤相关通路,是MDS发病的重要病理基础；含砷中药青黄散为主方案治疗MDS的机理在于对MDS异常高甲基化及低甲基化的双重调控作用,即以去甲基化为主,促甲基化为辅。第二部分雄黄主要成分As2S2对MDS来源细胞株F-36P的甲基化作用及机理研究目的：检测As2S2处理后MDS来源细胞株F-36P细胞DNA甲基化的改变,探讨As2S2对MDS来源细胞株F-36P的甲基化作用；检测As2S2处理后DNA甲基化转移酶(T1,3A,3B)的表达变化,探讨As2S2对F-36P细胞甲基化作用的机制。方法：运用DNA甲基化定量试剂盒观察As2S2对F-36P全基因组甲基化总体水平的作用；通过人类甲基化450K芯片技术观察经As2S2处理的F-36P中具体基因的甲基化状态变化；运用定量PCR技术(RT-PCR)研究As2S2对F-36P中高甲基化基因(BAK1)和低甲基化基因(FOLH1)表达的影响研究；运用RT-PCR技术检测DNA甲基化转移酶(DNMTS)的表达变化,探讨调节甲基化的作用机制。结果：1As2S2能够降低F-36P和HL-60细胞全基因组的甲基化水平以1μmol和2μmol的As2S2处理F-36P细胞72小时后,该细胞的甲基化水平明显下降；对于HL-60细胞,0.4μmol的As2S2不能降低甲基化水平,2μmol和10μmol的As2S2处理72小时后能降低该细胞株的基因组甲基化水平。2As2S2诱导F-36P细胞DNA双重甲基化：去甲基化与升甲基化在所分析的475,376个CpG位点中,2μmol As2S2能够导致F-36P细胞基因甲基化水平的明显变化,其中有19,832个位点(4.17%)的甲基化水平发生了显著的改变。在这19,832个位点中,共有7412(37.37%)个位点发生了高甲基化事件,有12,420(62.36%)位点发生了低甲基化事件。4μmol As2S2处理的F-36P细胞也出现了相似的结果：即共有21737个(4.57%)CpG位点甲基化水平发生了改变,其中8704个位点甲基化水平升高,13,033个位点甲基化水平下降。这些DNA甲基化改变时间和相关的RNA类型没有特别的相关性：即所有高甲基化和低甲基化位点都包括了mRNA, ncRNA和非编码RNA相关的CpG点。4μmol As2S2和2μmol As2S2都能降低或升高F-36细胞启动子区域不同CpG点甲基化水平,在CpG岛也见到了同样的情况：即4μmol As2S2和2μmol As2S2都能降低或升高F-36细胞CpG岛区域不同CpG点的甲基化水平。3As2S2对低甲基化(BAK1)和高甲基化基因(FOLH1) mRNA表达的影响通过RT-PCR观察了低甲基化基因BAK1和高甲基化基因FOLH1的mRNA表达水平。4μmol As2S272小时的处理能够显著增加BAK1的表达水平；对于高甲基化基因FOLH1,2μmol的As2S2能够显著减少FOLH1的表达水平。4As2S2对F-36P, HL-60和K562细胞DNA甲基化转移酶(1,3a,3b)表达研究As2S2处理后,DNMT1在F-36P, HL-60和K562中的表达没有显著变化；对于DNMT3a, As2S2处理后其在F-36P,HL-60和K562中的表达水平明显上升；DNMT3b在F-36P和K562细胞中表达没有显著变化,但是lOμmol As2S2能够增加该基因在HL-60中的表达。结论：As2S2对于F-36P细胞具有双重的甲基化作用：能够降低该细胞的全基因组甲基化水平,同时又能同时诱导高甲基化和低甲基化。而其机制可能在于通过提高DNMT3a的表达。证明As2S2能够对肿瘤抑制基因去甲基化,对致癌基因甲基化,而这或许就是雄黄治疗MDS/继发AML的机制所在。