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第一部分 Brg1在哮喘C57BL/6小鼠的肺组织和气道上皮异常表达目的:观察染色质重塑因子Brg1基因在哮喘C57BL/6小鼠的肺组织和气道上皮的异常表达,了解Brg1和哮喘的相关性。方法:将小鼠分为两组:正常对照组（control）和哮喘组（asthma）。小鼠在最后一次雾化48 h内依次进行AHR检测、支气管肺泡灌洗和BALF细胞计数,同时取BALF细胞沉渣涂片用于细胞分类计数,取肺病理组织用于HE染色、E-cadherin免疫组化染色,取肺组织标本用于提m RNA和蛋白进行Q-PCR和WB检测。结果:肺组织中Brg1的m RNA和蛋白水平在C57BL/6小鼠哮喘组明显升高,抗Brg1免疫组化染色显示Brg1在哮喘组的气道上皮上表达增多。结论:哮喘中Brg1的m RNA和蛋白水平均有明显升高,提示Brg1和哮喘有一定的相关性。同时发现Brg1在哮喘组的气道上皮上高表达,提示Brg1与气道上皮可能有一定的关系,进一步对Brg1进行研究也许可以发现哮喘气道上皮损伤后修复的其他机制。第二 部分Brg1基因敲除对C57BL/6哮喘小鼠气道上皮完整性的影响目的:观察Brg1基因对哮喘小鼠AHR、气道炎症和上皮marker E-cadherin的影响。方法:将Cre重组酶转基因小鼠（SFTPC-rt TA/（Tet O）7）与lox P转基因杂合子小鼠（Brg1lox P/lox P）杂交后筛出纯合型Brg1敲除鼠(Brg1-/-)。将哮喘小鼠分为四组:野生型小鼠正常对照组（WT ctrl）,野生型小鼠哮喘组（WT asthma）,Brg1基因敲除鼠正常对照组(Brg1-/-ctrl),Brg1基因敲除鼠哮喘组(Brg1-/-asthma)。小鼠在最后一次雾化48 h内依次进行有创肺功能气道高反应性AHR检测、支气管肺泡灌洗和BALF细胞计数,同时,BALF细胞沉渣涂片用于细胞分类计数,肺病理组织用于HE染色、E-cadherin免疫组化染色,取肺组织标本用于提m RNA和蛋白进行荧光定量PCR和WB检测。结果:有创肺功能AHR检测、BALF细胞计数结果显示,与WT asthma组相比,Brg1-/-asthma组的AHR明显下降,BALF中气道炎症细胞和嗜酸性细胞的数量均有明显降低。HE染色明确显示Brg1-/-asthma组气道周围炎症细胞的浸润明显减轻,气道上皮的完整性得到一定程度的改善。抗上皮marker E-cadherin免疫组化染色显示与WT asthma组的E-cadherin低表达相比,E-cadherin在Brg1-/-asthma组的气道上皮中表达增高,而Brg1-/-Ctrl组的E-cadherin的表达与WT Ctrl组相比无明显差异。气道炎症细胞、嗜酸性细胞数量与AHR指标LR均呈相关性。结论:Brg1基因的敲除可以明显降低C57BL/6哮喘小鼠的AHR、BALF中气道炎症细胞和嗜酸性粒细胞的数量和气道周围炎症细胞的浸润,同时增强了气道上皮marker E-cadherin的表达,提示Brg1基因的敲除可以增强哮喘气道上皮的完整性。第三部分 Brg1基因敲低对人支气管上皮细胞16HBE的修复能力的机制研究目的:利用慢病毒Brg1-sh RNA转染人支气管上皮细胞16HBE敲低Brg1后,观察Brg1对细胞增殖和迁移能力的影响及机制研究。方法:构建慢病毒Brg1干扰载体后,用构建的慢病毒表达载体和包装质粒（packaging mix）共转染293T细胞,包装病毒,用包装好的慢病毒（Brg1-sh RNA）以及慢病毒阴性对照（Brg1-sc RNA）感染16HBE,通过Western Blot和q PCR方法验证后得到稳定株。分别用细胞划痕实验、Transwell小室和CCK8、流式测细胞周期技术检测两组细胞株的迁移和增殖能力。将两种细胞株进行E-cadherin的荧光定量PCR和WB检测,同时荧光定量PCR检测另外两个上皮markers ZO-1和Occlubin1。双重荧光素酶报告基因分析两组细胞Brg1与E-cadherin的启动子区有无相互作用,Ch IP-PCR检测两组细胞Brg1与E-cadherin的3个启动子区序列的结合强度。结果:细胞划痕实验和Transwell小室实验结果显示Brg1基因的敲低可以促进气道上皮细胞的迁移能力,CCK8检测和流式测细胞周期结果显示Brg1基因的敲低可以促进气道上皮细胞的增殖能力,增殖能力增强主要表现为细胞周期的S期增高。荧光定量PCR和WB的结果显示,与未转染的16HBE细胞株和转染Brg1-sc RNA的细胞株相比较,转染Brg1-sh RNA的细胞株E-cadherin的m RNA水平和蛋白表达水平明显增高,而ZO-1和Occlubin1的m RNA水平无明显改变。双重荧光素酶报告基因显示,与转染Brg1-sh RNA的细胞株相比,转染Brg1-sc RNA的细胞株中Brg1与E-cadherin的启动子区的-1964/+941bp有较强结合,而其它序列无明显差异。Ch IP-PCR结果显示Brg1与E-cadherin的启动子区的第1段序列-86/+60 bp在转染Brg1-sc RNA的细胞株中结合最强,而另外两个启动子区序列在两组细胞株中无明显差异。结论:Brg1基因敲低后可以提高16HBE细胞的迁移和增殖能力,主要是Brg1基因通过与E-cadherin启动子区的-86/+60 bp结合来抑制E-cadherin的转录激活。