背景与目的乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤之一。研究发现乳腺癌是一系列原癌基因激活、抑癌基因失活导致的结果。一些基因如ERα、HER2、 ERK1/2等已被证实与乳腺癌发生发展密切相关,且针对这些基因的靶向药物他莫西芬、赫赛汀、AZD6244等已广泛应用于临床并取得了良好疗效,提高了乳腺癌患者的无病生存率,但随之出现的药物耐受仍是导致许多乳腺癌患者治疗失败的关键因素。AZD6244是针对MEK1/2的新型靶向治疗药物,通过有效的抑制RAF/MEK/ERK通路来抑制细胞增殖、凋亡、浸润转移。临床试验已经证明AZD6244具有较高安全性,在治疗结肠癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中取得了良好效果,能明显提高患者的无病生存期及无进展生存期。尽管如此,药物耐受的出现仍无法避免。已有文献报道AZD6244的耐药与BRAF、AKT、FOXO3a等基因的表达异常有关。FOXO3a是一个抑癌基因,它作为转录因子在调节细胞周期及凋亡的过程中起到重要作用。研究表明FOXO3a的表达异常与乳腺癌的发生、发展及预后密切相关。FOXO3a是AKT与ERK1/2的共同下游,已有研究显示在乳腺癌中MTDH (metadherin,又名AEG-1, lyric)(?)对AKT及ERK1/2的活性产生影响,由此我们推测MTDH基因在乳腺癌中可能会影响FOXO3a的表达活性。由于FOXO3a能增加AZD6244的药物敏感性,我们认为MTDH可能通过调节FOXO3a的活性来影响乳腺癌细胞对AZD6244的药物敏感性。MTDH是2002年发现的多功能新型原癌基因,在乳腺癌、食管癌、黑色素瘤、肝癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤组织中过度表达。MTDH对癌细胞的增殖、侵袭、转移及血管形成起到了重要的促进作用,并参与调节PI3K/AKT、MAPK、NF-kB等多条信号传导通路。我们课题组以往的研究结果显示MTDH基因的过表达出现在超过40%的乳腺癌患者的肿瘤组织中,并且与乳腺癌的预后密切相关；MTDH可以通过诱导细胞发生上皮间质转化来促进癌细胞的侵袭和转移；MTDH可导致细胞对多柔比星,紫杉醇,顺铂等多种化疗药物耐药。以上结果均提示MTDH作为一个多功能的原癌基因在乳腺癌的发生、发展及肿瘤耐药过程中起到不可忽视的作用。本实验拟通过构建针对MTDH基因的干扰载体,利用RNAi技术干扰乳腺癌细胞中MTDH基因的表达来探讨乳腺癌中原癌基因MTDH与抑癌基因FOXO3a的表达量及活性的关系,并研究MTDH调节FOXv3a的相关通路；研究MTDH基因对靶向治疗药物AZD6244药物敏感性的影响,验证MTDH是否通过调节FOXO3a的表达及活性来影响乳腺癌细胞对AZD6244的敏感性。方法设计两条针对MTDH基因的siRNA序列,根据pSUPER-retro-puro载体的说明构建MTDH干扰载体,经菌液PCR及质粒双酶切初步验证后再通过测序验证载体构建成功。分别用已构建成功的两个干扰载体(prpM1、prpM2)及对照的空载体(prpn)转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞系,嘌呤霉素筛选约一个月至未转染载体的细胞全部死亡,得到稳定表达MTDH干扰载体的细胞系231-prpM1、231-prpM2及相对应的稳定表达空载体的细胞系231-prpn,用实时定量PCR检测细胞mRNA水平上MTDH的干扰效果,Western blot检测细胞蛋白表达水平上MTDH干扰效果,选择干扰效果较好的细胞系命名为231-prpM用于后续实验。细胞筛选成功后,用Western blot检测MTDH干扰前后FOXO3a蛋白表达情况以评估MTDH对FOXO3a表达的影响。由于FOXO3a表达的减少主要是通过被活化的AKT及ERK1/2磷酸化后从胞核转移出至胞浆被蛋白酶体降解所致,所以用Western blot检测AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2的变化情况,以推测MTDH调节FOXO3a所经过的通路,进一步检测p-FOXO3a分析FOXO3a特异性磷酸化位点磷酸化情况的变化从而确定所经通路。由于FOXO3a的转录活性主要在细胞核内完成,为研究MTDH是否可以调节FOXO3a的活性,提取231-prpn及231-prpM的胞浆胞核蛋白,Western blot检测细胞胞浆及胞核内FOXO3a蛋白分布情况的变化以讨论MTDH对FOXO3a的活性的影响。对231-prpn及231-prpM细胞系用不同剂量的AZD6244处理后MTT法检测细胞存活率,绘制曲线,分析MTDH干扰后细胞系对于AZD6244的药物敏感性的变化,利用SPSS软件分析药物半数致死量,并运用统计学分析其差异性。对231-prpn及231-prpM细胞系用AZD6244做相应处理,流式细胞仪PI单染法检测MTDH干扰前后细胞GO/G1期阻滞情况的变化,并进行统计学分析；以sub-G1期来衡量细胞凋亡的情况,分析MTDH干扰前后细胞sub-G1期的变化,并进行统计学分析来讨论MTDH是否对AZD6244诱导的细胞凋亡产生影响。为证实FOXO3a在MTDH干扰后引起的乳腺癌细胞对AZD6244药物敏感性增加的过程中的重要性,我们设计合成针对FOXO3a基因的siRNA,转染已稳定筛选出的两株细胞系231-prpn及231-prpM以干扰其FOXO3a蛋白的表达,Western blot检测FOXO3a干扰效率,并用MTT法检测FOXO3a干扰前后两株细胞系对AZD6244药物敏感性的改变,并进行统计学分析,进一步验证所得推论即干扰MTDH导致的乳腺癌细胞对AZD6244的药物敏感性的增加是否通过激活FOXO3a来实现。结果MTDH干扰载体经测序验证已构建成功,经实时定量PCR及Western blot检测证实转染成功并筛选出稳定干扰MTDH的细胞系,且干扰效果良好。Western blot结果显示干扰MTDH的表达增加细胞FOXO3a表达量、抑制ERK1/2的活性但增强AKT的活性,提示MTDH干扰后FOXO3a表达量的增加是通过抑制ERK1/2的活性达到的,而不是通过AKT通路来实现。虽然western blot检测的ERK1/2特异的p-FOXO3a (Ser249)的表达量没有明显变化,但MTDH干扰后细胞p-FOXO3a占FOXO3a总表达量的比值明显降低(p<0.01),提示MTDH干扰后FOXO3a的磷酸化水平明显降低。对胞浆胞核中FOXO3a的表达情况的检测显示MTDH干扰后细胞核中FOXO3a含量明显增加而相对的细胞浆中的FOXO3a含量则明显减少,提示干扰MTDH的表达能增加细胞FOXO3a的活性。MTT结果显示MTDH干扰后细胞对于AZD6244的敏感性明显增强,其半数致死量由干扰前的6.04±0.08μ M减少至0.52±0.04μM(p<0.01)。周期结果显示MTDH干扰后乳腺癌细胞对AZD6244诱导的细胞周期G0/G1期阻滞明显增加(p<0.01),对sub-G1期进行分析后发现在MTDH干扰后的细胞中AZD6244诱导的凋亡率亦明显增加(p<0.01)。利用siRNA干扰231-prpn及231-prpM细胞中FOXO3a的表达,Western blot检测结果显示干扰效果良好。两株细胞系干扰FOXO3a前后的MTT结果显示在231-prpn细胞系中FOXO3a干扰前后细胞对AZD6244敏感性无明显变化,而在231-prpM细胞系中,FOXO3a干扰后使细胞对AZD6244敏感性降低,这提示在231-prpn细胞系中由于FOXO3a蛋白活性较低,所以FOXO3a的表达对AZD6244的敏感性无明显影响,而在MTDH基因表达被干扰后,FOXO3a表达量及活性增加从而增加了细胞对AZD6244的敏感性。结论1.实验进一步支持了MTDH在乳腺癌中是一个多功能的原癌基因这一观点,并且MTDH可能通过抑制抑癌基因FOXO3a的表达来促进乳腺癌的增殖、侵袭及转移。2. MTDH通过MTDH/ERK1/2/FOXO3a而不是MTDH/AKT/FOXO3a通路调节FOXO3a的表达及活性。3. MTDH的表达能影响乳腺癌细胞对靶向药物AZD6244的敏感性。4. MTDH通过MTDH/ERK1/2/FOXO3a传导通路影响乳腺癌对AZD6244的敏感性。意义1.在乳腺癌中研究了MTDH与FOXO3a之间的关系及相关的信号传导通路。2.研究了MTDH对新型靶向治疗药物AZD6244敏感性的影响,及产生影响所经通路。3.为MTDH基因作为新的治疗靶点提供依据。