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2002年，瑞典科学家在富含碳水化合物的热加工食品中首次发现高含量的丙烯酰胺，由此引发的食品安全问题备受国际关注。丙烯酰胺及其一级代谢产物环氧丙酰胺可以血红蛋白结合物的形式通过胎盘屏障进入胎儿体内，其发育毒性已在欧洲大型母婴队列研究中得以证实。此外，本课题组前期人群队列研究表明，丙烯酰胺的体内暴露水平与心血管疾病的发生率和死亡率呈显著正相关性。心脏是脊椎动物最早形成并发挥功能的器官，特别是早于解毒器官肝脏。因此，本文以斑马鱼胚胎为模型，从急性和亚慢性角度探究丙烯酰胺心脏发育毒性及其致毒机制。主要研究结果如下：
首先，丙烯酰胺急性暴露对斑马鱼胚胎具有明显的致死致畸作用，且呈剂量依赖和时间依赖关系。受精后的斑马鱼胚胎暴露于丙烯酰胺72和96小时的半致死剂量（LC50）分别为2.7mM和2.2mM，主要表型为心包水肿、心率缓慢、心脏线性化、体长减小和鱼鳔无法发育等。毒性敏感性评估研究表明，发育早期阶段暴露丙烯酰胺，胚胎心脏的畸形表型最为显著。活性氧（ROS）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）含量和谷胱甘肽硫转移酶（GST）活性等氧化还原指标观测发现，2.0mM丙烯酰胺暴露组胚胎出现明显的氧化损伤，且活性氧探针染色和油红O染色结果发现，心脏区域出现大量阳性染色信号，而低于2.0mM暴露组胚胎与对照组相比并无明显差异。该结果意味着氧化损伤可能是高剂量丙烯酰胺的致毒途径，心脏可能是丙烯酰胺致发育毒性的靶器官。
其次，丙烯酰胺急性暴露对斑马鱼胚胎具有明确的心脏发育毒性。2.0mM丙烯酰胺暴露后，胚胎心脏静脉窦-动脉球间距显著变大、心室横截面积和心室容积显著减小；而在功能上，心率、心室收缩分数和红细胞流速均显著下降。整胚原位杂交和定量PCR观测发现，丙烯酰胺暴露导致心管环化不全，腔室膨胀异常；心脏房室发育中心肌蛋白myl7、vmhc和myh6基因表达下调；房室通道分化中bmp4、notch1b和tbx2b基因限制性表达的功能部分或完全丧失；房室瓣膜形成过程中has2、klf2a和nfatc1基因异位表达；心脏疾病相关标志基因nppa和nppb异位高表达，而tnnc1a显著下降。上述结果意味着丙烯酰胺急性暴露抑制房室心肌蛋白的形成、房室通道的分化和瓣膜发育，并出现病理性特征。此外，中胚层心脏前体标志物nkx2.5表达下调，暗示了丙烯酰胺急性暴露对心脏发育的影响可能始于心脏前体时期。
第三，丙烯酰胺急性暴露抑制心脏发育过程中细胞的增殖和分化。丙烯酰胺暴露后显著降低了心肌细胞和心内膜细胞的数目。通过增殖标志物PH3免疫荧光和TUNEL凋亡等观测发现，丙烯酰胺并不影响心脏发育过程中细胞凋亡水平，但显著抑制其有丝分裂，这是导致细胞数目减少的可能原因。丙烯酰胺并不影响心脏腔室心肌细胞的特异性分化，但显著抑制房室通道处心内膜细胞从上皮细胞向间质细胞转变的过程。此外，丙烯酰胺暴露导致发育早期心肌和心内膜之间的物理间隙增加，二者之间交错信号（crosstalk）减少，随着暴露时间的延长，心室心肌层和心内膜明显增厚，暗示心脏成熟期发育可能出现异常。
第四，丙烯酰胺亚慢性暴露对心脏早期发育过程中的形态和功能虽无明显影响，但显著影响心脏成熟过程中的形态发生和收缩功能。通过Notch信号荧光报告转基因鱼系Tg(TP1:d2GFP)发现，0.5mM和1.0mM丙烯酰胺暴露导致心脏发育早期心内膜Notch信号部分失去瞬时动态活性，进而持续高表达至肌小梁形成早期，而心肌层Notch信号在肌小梁形成后期持续高表达，最终导致肌小梁芽增生和无法迁移。通过Notch信号抑制剂DAPT对心内膜Notch信号进行不完全抑制后，新生的肌小梁正常发育并向腔室内部延伸，从而起到拯救效果。以上结果表明，丙烯酰胺亚慢性暴露影响心脏发育早期阶段心内膜失去部分活性，无法实现Notch信号限制性表达，进而导致后期肌小梁过度增殖，而成熟后期心肌Notch信号的高表达属于应激反应。
第五，丙烯酰胺亚慢性暴露引起心室壁肌小梁增生且无法迁移而堆积于心室壁，可能原因为：（1）经1.0mM丙烯酰胺暴露后，Notch下游通路中erbb2在肌小梁形成早期显著上调，而nrg2a在肌小梁形成过程中显著上调，这是肌小梁增生的可能原因；（2）受Erbb2信号调控的N-cadherin蛋白大量聚集且无法重排，大大增加了心肌细胞之间的粘附性，是导致新生肌小梁无法迁移而堆积于心室壁的可能原因；（3）心肌细胞能量代谢和收缩运动所需的线粒体和肌原纤维结构异常，是导致成熟期心室收缩功能下降的可能原因。此外，丙烯酰胺亚慢性暴露可致心脏早期发育关键特异性转录因子nkx2.5和hand2等在心室成熟期高表达，可能为斑马鱼心脏损伤后的特有再生应激反应。
综上所述，本研究以斑马鱼胚胎为模型，从毒理学效应、细胞生物学机制以及分子机制等层面系统研究丙烯酰胺急性暴露和亚慢性暴露后对心脏发育的影响及其致毒机理，相关研究成果为完善食品加工污染物发育毒性和毒理学效应评价体系提供科学依据，对于我国食品化学安全危害因素的循证和溯源研究具有重要意义。
首先，丙烯酰胺急性暴露对斑马鱼胚胎具有明显的致死致畸作用，且呈剂量依赖和时间依赖关系。受精后的斑马鱼胚胎暴露于丙烯酰胺72和96小时的半致死剂量（LC50）分别为2.7mM和2.2mM，主要表型为心包水肿、心率缓慢、心脏线性化、体长减小和鱼鳔无法发育等。毒性敏感性评估研究表明，发育早期阶段暴露丙烯酰胺，胚胎心脏的畸形表型最为显著。活性氧（ROS）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）含量和谷胱甘肽硫转移酶（GST）活性等氧化还原指标观测发现，2.0mM丙烯酰胺暴露组胚胎出现明显的氧化损伤，且活性氧探针染色和油红O染色结果发现，心脏区域出现大量阳性染色信号，而低于2.0mM暴露组胚胎与对照组相比并无明显差异。该结果意味着氧化损伤可能是高剂量丙烯酰胺的致毒途径，心脏可能是丙烯酰胺致发育毒性的靶器官。
其次，丙烯酰胺急性暴露对斑马鱼胚胎具有明确的心脏发育毒性。2.0mM丙烯酰胺暴露后，胚胎心脏静脉窦-动脉球间距显著变大、心室横截面积和心室容积显著减小；而在功能上，心率、心室收缩分数和红细胞流速均显著下降。整胚原位杂交和定量PCR观测发现，丙烯酰胺暴露导致心管环化不全，腔室膨胀异常；心脏房室发育中心肌蛋白myl7、vmhc和myh6基因表达下调；房室通道分化中bmp4、notch1b和tbx2b基因限制性表达的功能部分或完全丧失；房室瓣膜形成过程中has2、klf2a和nfatc1基因异位表达；心脏疾病相关标志基因nppa和nppb异位高表达，而tnnc1a显著下降。上述结果意味着丙烯酰胺急性暴露抑制房室心肌蛋白的形成、房室通道的分化和瓣膜发育，并出现病理性特征。此外，中胚层心脏前体标志物nkx2.5表达下调，暗示了丙烯酰胺急性暴露对心脏发育的影响可能始于心脏前体时期。
第三，丙烯酰胺急性暴露抑制心脏发育过程中细胞的增殖和分化。丙烯酰胺暴露后显著降低了心肌细胞和心内膜细胞的数目。通过增殖标志物PH3免疫荧光和TUNEL凋亡等观测发现，丙烯酰胺并不影响心脏发育过程中细胞凋亡水平，但显著抑制其有丝分裂，这是导致细胞数目减少的可能原因。丙烯酰胺并不影响心脏腔室心肌细胞的特异性分化，但显著抑制房室通道处心内膜细胞从上皮细胞向间质细胞转变的过程。此外，丙烯酰胺暴露导致发育早期心肌和心内膜之间的物理间隙增加，二者之间交错信号（crosstalk）减少，随着暴露时间的延长，心室心肌层和心内膜明显增厚，暗示心脏成熟期发育可能出现异常。
第四，丙烯酰胺亚慢性暴露对心脏早期发育过程中的形态和功能虽无明显影响，但显著影响心脏成熟过程中的形态发生和收缩功能。通过Notch信号荧光报告转基因鱼系Tg(TP1:d2GFP)发现，0.5mM和1.0mM丙烯酰胺暴露导致心脏发育早期心内膜Notch信号部分失去瞬时动态活性，进而持续高表达至肌小梁形成早期，而心肌层Notch信号在肌小梁形成后期持续高表达，最终导致肌小梁芽增生和无法迁移。通过Notch信号抑制剂DAPT对心内膜Notch信号进行不完全抑制后，新生的肌小梁正常发育并向腔室内部延伸，从而起到拯救效果。以上结果表明，丙烯酰胺亚慢性暴露影响心脏发育早期阶段心内膜失去部分活性，无法实现Notch信号限制性表达，进而导致后期肌小梁过度增殖，而成熟后期心肌Notch信号的高表达属于应激反应。
第五，丙烯酰胺亚慢性暴露引起心室壁肌小梁增生且无法迁移而堆积于心室壁，可能原因为：（1）经1.0mM丙烯酰胺暴露后，Notch下游通路中erbb2在肌小梁形成早期显著上调，而nrg2a在肌小梁形成过程中显著上调，这是肌小梁增生的可能原因；（2）受Erbb2信号调控的N-cadherin蛋白大量聚集且无法重排，大大增加了心肌细胞之间的粘附性，是导致新生肌小梁无法迁移而堆积于心室壁的可能原因；（3）心肌细胞能量代谢和收缩运动所需的线粒体和肌原纤维结构异常，是导致成熟期心室收缩功能下降的可能原因。此外，丙烯酰胺亚慢性暴露可致心脏早期发育关键特异性转录因子nkx2.5和hand2等在心室成熟期高表达，可能为斑马鱼心脏损伤后的特有再生应激反应。
综上所述，本研究以斑马鱼胚胎为模型，从毒理学效应、细胞生物学机制以及分子机制等层面系统研究丙烯酰胺急性暴露和亚慢性暴露后对心脏发育的影响及其致毒机理，相关研究成果为完善食品加工污染物发育毒性和毒理学效应评价体系提供科学依据，对于我国食品化学安全危害因素的循证和溯源研究具有重要意义。