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佛手(Citrus medica var.L.sascodactylis Swingle)是芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus spp.)植物,属于香橼(CmedicaL.)的变种。佛手本身果实奇特,与香橼亲缘关系很相近,但二者的果实形态有着极大差异。CRABS CLAW(CRC)和YABBY5基因都是YABBY基因家族成员,属于植物中特有的一类转录因子,对于植物的生长发育及形态建成具有重要的生物学功能。本研究用形态学手段观察佛手果形早期发育的历程,并以金华青皮佛手和香橼为材料,克隆分析CRC和YABBY5基因的序列结构,利用实时荧光定量PCR技术及病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术分析两个YABBY因家族成员的表达和功能特性。1.采集1mm、1.5 mm、2 mm、2.5 mm、3 mm、3.5 mm、4 mm、5 mm、6 mm、7mm、8 mm、9mm、10 mm佛手花芽、开花当天佛手花及开花后佛手幼果。通过超景深显微镜和扫描电镜观察不同发育阶段的佛手花芽形态,结果显示,当芽体约1mm时进入花萼分花期,约2 mm时进入雄蕊分化期(SD),约3～4 mm时进入雌蕊分化期(GD)。且早期花芽心皮原基就已出现了指状突起,这些指状凸起包含柱头和花柱,但是随着花的开放,柱头早落,子房也出现了的指状凸起。由此表明,佛手指状部分由雌蕊子房发育而来,果形建成于开花前。2.通过甜橙基因组数据分析设计相关引物,以香橼为对照材料,分别在佛手、香橼中克隆了CR 基因启动子序列和YABBY5基因gDNA和cDNA全长序列。在NCBI中比对佛手、香橼CRC启动子的基因序列,相似度为98%。通过PlantCARE软件对CRC启动子进行预测分析,发现两段序列中均含有多种高等植物基因启动子的保守功能元件,说明该序列具有启动子活性。但与香橼相比,佛手CRC启动子缺失两个TATA-Box元件,推测CRC启动子在佛手中缺失序列可能引起CRC表达受影响。将佛手与香橼YABBY5基因序列与氨基酸序列进行比对。结果发现,佛手YABBY5基因cDNA序列与香橼比对缺失21bp,其氨基酸序列与香橼相比缺失7个氨基酸,且缺失序列出现在其保守区域(CDs),因此认为YABBY5基因可能会影响佛手的果实发育。3.分别在佛手雄蕊分化期(SD)、雌蕊分化期(GD)、开花前6天、开花当天、花后3天、花后6天及后9天等不同发育时期进行取样,利用qRT-PCR技术对两个基因的表达情况进行分析。对CRC和YABBY5在佛手、香橼花器官不同时期的表达量检测显示,CRC基因在佛手开花前后表达下调,且在花器官发育各时期的表达量均显著低于香橼;YABBY5基因在佛手开花前后表达上调,但在各时期的表达量也都显著低于香橼。前期研究表明,佛手经高温诱导后会产生近似香橼的拳状果形。将新梢停长的佛手分别置于20℃和:5℃处理60天,再于25/18℃恒温培养至花芽形态分化期进行取样,检测高低温诱导后佛手花器官不同时期的表达量。结果显示:在开花前3天、开花当天和开花后3天,高温诱导后CRC基因表达水平显著高于低温诱导的情况,且花后表达水平降低;高温诱导后YABBY5基因在花后的表达水平均高于低温诱导的表达水平,其中开花三天内差异最显著。从表达趋势分析,CRC、YABBY5基因在高温诱导后佛手花器官的表达情况更接近香橼,由此说明,以上两个Y4BBY基因与佛手的果形建成相关。4.以子叶出土后30天左右的番茄Micro-Tom进行试验,利用VIGS技术沉默番茄SlYABBY5b基因cDNA片段。结果显示:沉默SlYABBY5基因的植株在处理30d后稳定坐果,且果实上端拉长变尖近梨形或出现凸起,此表型一直持续到处理后60 d,但果实的转色并未受到影响。在阴性对照组与实验组中各选取25个番茄果实,经过Tomato Analyzer 3.0软件分析,SlYABBY5沉默30-60 d左右的番茄果被拉长,且沉默组果实果尖夹角显著小于对照组果实(P<0.01)。果实高度在46-63 mm的区间内,沉默果实数目大于对照组;果尖角度在80°-119°的范围内,沉默组果实数目是对照组的2倍。利用STRING网站及参考相关文献对YABBY5互作基因进行预测分析,发现在拟南芥中,KAN、KAN2、ETT、WOX1、AT4G38840.1、SUN和OVATE七个基因可能与YABBY5互作。检测YABBY5及其预测互做基因在对照组与沉默组果实中的表达水平。结果表明,SlYABBY5基因在沉默果实中表达量下降,其它基因的表达水平也出现变化。可见,YABBY5基因的下调会影响果实形状,作为转录因子也能影响下游基因的表达。综上,从表达水平及遗传转化的角度分析,佛手的YABBY5参与了果实的生长发育,是果形建成的关键基因。CRC启动子的缺失和低表达相关是否与佛手果形建成相关还需后续实验探讨。