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环形泰勒虫病是由环形泰勒虫(Theileria annulata)寄生于牛的淋巴细胞和红细胞内所引起的蜱传性血液原虫病,其典型临床症状表现为发热、贫血、黄疸、消瘦及体表淋巴结肿大,严重时常可造成动物死亡,是严重影响养殖业发展的重要寄生虫病之一。该病为典型虫媒病,主要通过残缘璃眼蜱、小亚璃眼蜱和盾糙璃眼蜱等硬蜱传播,因此,发病季节与蜱的活动密切相关,通常在5、6月份开始出现,7月份达到高峰,8、9月份逐渐消失。为建立针对牛环形泰勒虫病的特异性诊断方法,本研究以环形泰勒虫子孢子表面抗原(sporozoite surface antigen,SPAG)基因为靶标分子,设计特异性引物,对其进行克隆测序,建立荧光定量PCR检测方法,并对环形泰勒虫不同发育阶段SPAG基因的转录水平进行分析;构建重组质粒,原核表达SPAG重组蛋白,并对重组蛋白的反应原性和特异性进行分析;以重组蛋白为抗原,建立了可用于环形泰勒虫病抗体检测的间接ELISA诊断方法,对该方法进行评价和初步应用。主要内容如下:1.根据GenBank公布的子孢子表面抗原(SPAG)基因序列,设计全基因扩增引物,对环形泰勒虫喀什株、伊犁株和内蒙古株的SPAG基因进行克隆和测序,得到环形泰勒虫喀什株、伊犁株、内蒙古株的SPAG基因大小分别为2706 bp、3051 bp和2733 bp,它们之间的相似性达到90%以上;以SPAG基因为靶标,建立了荧光定量PCR检测方法,并对其反应条件进行优化。结果表明,该方法可特异性检测环形泰勒虫感染,最低检出量为10 copies/μL,且与中华泰勒虫、东方泰勒虫、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫和大巴贝斯虫无交叉反应,批内重复试验和批间重复试验的变异系数均小于5%。用该方法对环形泰勒虫子孢子、裂殖体和红细胞虫体三个不同发育阶段的SPAG基因转录水平进行了分析,发现该基因在三个发育阶段均有表达,其中子孢子阶段表达量最高,裂殖体阶段表达量最低。同时,应用该方法对采自湖北、甘肃、陕西、云南4省的422份样品进行了检测,阳性检出率分别为10.00%(6/60)、3.38%(7/207)、0(0/60)和4.21%(4/95),较普通PCR方法更敏感。2.对SPAG基因序列进行生物信息学分析,针对三个虫株的保守区域序列设计引物并扩增,构建重组表达质粒,诱导表达后纯化SPAG重组蛋白。得到目的基因的长度为882 bp,重组蛋白的分子量大小约为42 ku。Western Blot试验表明,诱导表达的重组蛋白可特异性地与环形泰勒虫阳性血清发生反应,而与中华泰勒虫、东方泰勒虫、牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的阳性血清无交叉反应,表明该蛋白可作为环形泰勒虫病血清学诊断的候选抗原。3.以纯化的SPAG重组蛋白作为抗原,建立了牛环形泰勒虫病间接ELISA诊断方法,对该方法的反应条件进行了优化,仅能检测出环形泰勒虫阳性血清,而与东方泰勒虫、中华泰勒虫、双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫等梨形虫阳性血清无交叉反应。应用所建立的方法对实验感染动物的抗体动态进行观察,结果显示感染后第7天可检测到抗体,第27至33天抗体水平达到高峰,145天后抗体下降至感染前水平;并对新疆、甘肃、青海、陕西、湖北、广西、湖南、贵州和四川9个省的1654份野外样品进行检测,血清阳性率分别为27.15%、22.99%、14.22%、16.67%、50.00%、46.88%、53.57%、35.96%和59.32%。