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[目的]T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白分子(Tim)-3是新近发现的一种共刺激分子,特异性表达在辅助I型T淋巴细胞(Th1)上。可溶性Tim-3(sTim-3)是Tim-3的可溶性蛋白形式,与病情发展具有相关性。Tim-3还表达于多种天然免疫细胞上,如单核细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突状细胞上,而Tim-3过表达于这些细胞上与病情恶化有关。原发性胆汁性胆管炎(PBC)时NK细胞显著增加,被认为是多种自身免疫性疾病的始作俑者。病理状态下NK细胞聚集在肝脏,可能与其表面的受体CXCR1趋化作用有关。Tim-3参与多种自身免疫性疾病的发生发展,但在PBC疾病中的机制研究尚不清楚。因此,我们建立2OA-BSA诱导的PBC动物模型。探究Tim-3及其天然配体半乳糖凝激素-9(Gal-9)的表达情况,观察血清sTim-3水平的变化。分析PBC时NK细胞分布特点和表面分子的表达情况。给予NK细胞不同干预,研究Tim-3对NK细胞表面分子和分泌功能的调控作用。阐明NK细胞趋化的上游调控机制,为临床诊疗寻找新靶点提供理论依据。[方法]第一部分:原发性胆汁性胆管炎小鼠模型Tim-3和Gal-9的表达①PBC模型的建立:采用2-辛炔酸牛血清蛋白联合聚肌苷酸胞苷酸给予C57BL/6雌性小鼠腹腔注射方法,药物诱导形成PBC动物模型;②采集小鼠血清,全自动生化分析仪检测肝生物化学指标;③ELISA检测血清sTim-3和AMA-M2水平;④提取小鼠肝脏、脾脏和肝脏NK细胞总mRNA,qRT-PCR分析Tim-3和Gal-9的mRNA水平;⑤组织学观察肝脏炎症浸润和胆管病变情况;⑥免疫组织化学法观察Tim-3和Gal-9在肝脏和脾脏中的表达情况。第二部分:原发性胆汁性胆管炎时NK细胞频数及亚群的研究①分离外周血、脾脏和肝脏单个核细胞,给予APC-CD3、PerCP-NK1.1、PE-Tim-3和FITC-CXCR3荧光抗体标记,流式细胞仪分析以上不同组织T淋巴细胞、NK细胞和NKT细胞分布情况;②流式细胞仪分析Tim-3+NK细胞和CXCR3+NK细胞在不同来源NK细胞中的比例。第三部分:Tim-3调控NK细胞亚群及功能的研究①采用NK细胞阴性分选试剂盒,分离纯化肝脏及脾脏NK细胞。将105NK细胞种植于12孔板中,用RPMI 1640配制的完全培养基培养,其内包含10%的胎牛血清、1%的青链霉素和200U/ml重组小鼠IL-2;②提取小鼠肝脏和肝脏NK细胞总mRNA,qRT-PCR分析CXCR1的mRNA水平;③提取PBC模型组肝脏单个核细胞并培养,分为四组,空白组不给予任何干预,其余干预组分别给予50μg/ml重组小鼠Tim-3 Fc、重组小鼠Gal-9蛋白和脂多糖干预。流式细胞术分析Tim-3+NK细胞和CXCR3+NK细胞的变化;④提取C57BL/6小鼠脾脏NK细胞并培养,分为三组,空白组不给予任何干预,其余干预组分别给予50μg/ml脂多糖和50μg/ml脂多糖+重组小鼠Tim-3 Fc干预。分别收集NK细胞和培养上清。提取NK细胞总mRNA,qRT-PCR分析CXCR1的mRNA水平。ELISA检测培养上清IFN-γ水平。[结果]第一部分:原发性胆汁性胆管炎小鼠模型Tim-3和Gal-9的表达①2OA-BSA免疫诱导的PBC小鼠模型模拟了人类PBC疾病,以汇管区及胆管周围炎症形成,特异性自身抗体AMA-M2出现,ALP升高为特征;②PBC时,Tim-3在肝脏中表达升高,而Gal-9表达无明显差异,但在肝脏汇管区炎症浸润处大量表达;③PBC时,Tim-3和Gal-9在脾脏中表达升高,主要分布于脾脏白髓区,而红髓区有少量表达;④血清sTim-3在PBC模型组中低于对照组,可能参与了 PBC的免疫调控。第二部分:原发性胆汁性胆管炎时NK细胞频数及亚群的研究①PBC模型组T淋巴细胞在肝脏和外周血中比例显著增高,而在脾脏中则降低;②NK细胞在PBC模型组肝脏中显著增高,而在外周血和脾脏中无显著差异;③与对照组相比,PBC模型组外周血和肝脏NKT细胞比例显著升高;④PBC模型组肝脏及外周血Tim-3^NK细胞增多,而在脾脏中分布减少;⑤PBC模型组外周血以CXCR3^NK细胞亚群为主。第三部分:Tim-3调控NK细胞亚群及功能的研究①给予重组小鼠Gal-9和脂多糖刺激NK细胞,促进Tim-3的表达;②重组小鼠Tim-3 Fc阻断Tim-3通路和脂多糖可促进NK细胞表达CXCR3,而给予重组小鼠Gal-9则抑制CXCR3在NK细胞上的表达;③PBC模型组肝脏和肝脏NK细胞CXCR1 mRNA显著增高;④脂多糖能上调NK细胞CXCR1的表达,并促进NK细胞分泌IFN-γ。同时给予重组小鼠Tim-3 Fc阻断Tim-3通路,则抑制CXCR1的表达和IFN-γ的分泌功能。[结论]①Tim-3/Gal-9在PBC小鼠中表达失调,并参与PBC的发病;②PBC时浸润肝脏的T淋巴细胞、NK细胞和NKT细胞显著增多,此外T淋巴细胞和NKT细胞在外周血也明显增多;③PBC时外周血和肝脏中Tim-3+NK细胞亚群增多,其中外周血以CXCR3+NK细胞亚群(在人类与CD56highNK细胞亚群相对应)为主;④肝脏免疫微环境中CXCR1表达上调,并参与PBC疾病的发生发展;⑤引导NK细胞迁徙至炎症区域的趋化性受体主要是CXCR1而非CXCR3;⑥Tim-3通路可上调NK细胞表达CXCR1和分泌IFN-γ,抑制CXCR3免疫调控作用;⑦CXCR3在NK细胞上的表达可能与机体免疫耐受有关。