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子痫前期是常见的妊娠期特发性疾病。重度子痫前期,是孕产妇及围生儿发病及死亡的主要原因之一。子痫前期发病的中心环节是患者全身弥漫性内皮细胞激活/损伤。因为chemerin是一个新发现的与高血压、炎症免疫、肥胖胰岛素抵抗、代谢综合征等密切相关的脂肪细胞因子,同时子痫前期与心血管疾病及代谢性疾病有着共同的危险因素,且子痫前期孕妇产后远期心血管疾病及代谢性疾病的风险增高,这些提示chemerin可能在子痫前期病变中有重要作用。目前数据大多来源于血清chemerin在内科疾病中的研究。Chemrin与子痫前期的关系少见报道,而chemerin对内皮细胞功能的调控作用更是罕见。本博士课题对chemerin在孕妇血清胎盘中的表达及人脐静脉内皮细胞中的作用进行探讨,以期对子痫前期发病及治疗提供新的靶点。第一部分：脂肪因子chemerin在子痫前期中的表达变化及意义目的：研究脂肪因子chemerin(又称他扎罗汀诱导基因2或者视黄酸受体反应蛋白2,RARRES2)与子痫前期发病的关系。方法：选取2012年1月～2013年1月在中南大学湘雅二医院产检并分娩的孕晚期、单胎、初诊为子痫前期(PE)的孕妇。其中轻度子痫前期(MPE)孕妇30例,重度子痫前期(SPE)孕妇30例；随机选取同期单胎正常妊娠孕妇28例为正常对照组(NC)。采用ELISA检测各组孕妇血清chemerin水平,利用FQ-PCR和Western Blot分别检测各组孕妇胎盘组织中chemerin mRNA和蛋白的表达水平,并进行统计学分析。结果：1.MPE组孕妇血清chemerin水平为(330.23±56.22) ng/ml, SPE组为(493.83±105.23) ng/ml,对照组为(220.00±50.78) ng/ml;两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.MPE组孕妇胎盘组织中chemerin mRNA的相对表达量为(3.04×10-4±0.87×10-4),SPE组为(4.00×10-4±1.11×10-4),对照组(1.13×10-4±0.54×10-4)；两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.MPE组孕妇胎盘组织中chemerin蛋白的相对表达量为(1.20±0.17),SPE组为(1.84±0.40),对照组为(0.57±0.15),两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。4.孕妇血清chemerin水平与胎盘组织chemerin mRNA、蛋白的表达水平及收缩压、舒张压、BMI及血清胰岛素呈正相关,与eNOS呈负相关,相关系数r值分别为0.690(P<0.001)、0.655(P<0.001)、0.724(P<0.001)、0.627(P<0.001)、-0.727(P<0.001)。结论：1.孕妇外周血清及胎盘组织中均有chemerin的表达。2.子痫前期孕妇外周血清及胎盘组织中chemerin的表达水平与病情严重程度有关。第二部分：Chemerin对脐静脉内皮细胞(HUVECs)功能的影响目的：培养人原代脐静脉内皮细胞(HUVECs)并研究chemerin对HUVECs分泌NO功能的影响。方法：获取新鲜的脐带组织,用酶消化法培养出HUVECs,用HUVECs特异性抗体第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色进行鉴定。将HUVECs分组,分别给予不同浓度的chemerin (0,10,100,500,1000ng/ml)或不予chemerin干预HUVECs12、24.48小时后,收集上清培养液,用GriessReagent试剂盒测定细胞培养液中的亚硝酸盐(nitrite, N02-)的浓度,其作为NO的稳定代谢产物反映NO的浓度变化。结果：(1)镜下观察细胞生长良好,内皮细胞呈单层铺路石样外观。经过镜下观察和Ⅷ因子相关抗原鉴定证明是脐静脉内皮细胞。(2)不同浓度chemerin干预不同时间后,浓度为10～500ng/ml的chemerin诱导培养HUVECs后收集培养上清液中NO的浓度比对照组升高,具有统计学意义(P<0.05),且随chemerin浓度增加NO浓度升高(P<0.05)。而浓度500、1000ng/ml处理HUVECs不同时间后NO的产生差异无明显统计学意义(P>0.05)。结论：原代人脐静脉内皮细胞培养成功；浓度为10～1000ng/ml的chemerin上调HUVECs NO产生,且在0～500ng/ml范围内呈剂量依赖性。第三部分：Chemerin调控HUVECs分泌NO作用及机制研究目的：探讨chemerin在诱导脐静脉内皮细胞(HUVECs)产生一氧化氮(NO)中的作用及其机制。方法：(1)用蛋白印迹法(West Blot)检测用0,10,100,500,1000ng/ml chemerin处理后24h,HUVECs中一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)第1177位的丝氨酸(serine-1177, Ser-1177)的磷酸化状态,同时检测丝/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase, Akt)第473位的丝氨酸(serine-473, Ser-473)的磷酸化状态变化。(2)为确定chemerin作用的信号通路,分别应用P13K抑制剂LY294002或eNOS抑制剂L-NAME与chemerin共同干预,观察能否影响chemerin对磷酸化eNOS Ser-1177和Akt Ser-473蛋白表达。结果：(1) Chemerin组较对照组p-eNOS及p-Akt蛋白表达增高(P<0.05)；并在0～500ng/ml范围内呈剂量依赖性(P<0.05)。(2)Chemerin+LY294002组p-AKT、p-eNOS水平较chemerin组下降(p<0.05); chemerin+L-NAME组p-eNOS水平较chemerin组下降(P<0.05)。结论：浓度为0～1000ng/ml的chemerin通过活化P13K-AKT-eNOS信号通路上调NO产生；且在0～500ng/ml范围内呈剂量依赖性。第四部分：chemerin抑制TNF-a诱导的HUVECs的VCAM-1蛋白表达目的：探讨chemerin对TNF-a诱导脐静脉内皮细胞(HUVECs)的产生VCAM-1的作用及其机制。方法：(1)TNF-a通过NF-κB途径诱导HUVECs损伤模型：将不予药物干预的正常培养细胞作为对照组；将给予5ng/ml的TNF-a干预6小时的细胞(即]HUVECs损伤模型),作为研究1组；将给予5ng/ml的TNF-a干预6小时后+10μM NF-κB抑制剂(吡咯烷二硫代甲酸铵盐,PDTC)30分钟作为研究2组；(2)chemerin对TNF-α诱导下HUVECs表达NF-κB和VCAM-1的影响：将不予药物干预的正常培养细胞作为对照组；将给予5ng/ml的TNF-α干预6小时的细胞(即]TUVECs损伤模型)作为研究1组；将给予500ng/ml的chemerin预处理24小时后+5ng/ml的TNF-a干预6小时作为研究2组；将给予500ng/ml的chemerin+5μmol/ml的LY294002预处理24小时后+5ng/ml的TNF-α干预6小时作为研究3组；将给予500ng/ml的chemerin+0.5mmol/ml的L-NAME预处理24小时后+5ng/ml的TNF-a干预6小时作为研究4组。各组分别收集蛋白检测磷酸化NF-κB p65(Ser536)及VCAM-1蛋白表达。结果：(1)与对照组比较,TNF-a组NF-κB及VCAM-1蛋白表达水平升高(P<0.05); TNF-a+PDTC组NF-κB及VCAM-1的蛋白表达较TNF-α组降低(P<0.05),但与对照组比较仍有差异(P<0.05)。结果表明TNF-α通过NF-κB诱导HUVECs的VCAM-1的水平上调。(2)chemerin+TNF-a组VCAM-1和NF-κB的蛋白表达水平较TNF-a组下降(P<0.05); chemerin+TNF-a+LY29004组VCAM-1和]SIF-κB蛋白表达水平较chemerin+TNF-a组升高(P<0.05)；chemerin+TNF-a+L-NAME组VCAM-1和NF-κB蛋白表达水平较chemerin+TNF-α组也升高(P<0.05)。结论：(1)在HUVECs中,TNF-α通过NF-κB通路上调VCAM-1的表达；Chemerin可通过抑制TNF-α导致的NF-κB的磷酸化下调VCAM-1的表达；Chemerin对TNF-α诱导内皮细胞损伤模型起抗炎作用；Chemerin的抗炎作用是通过PI3K-Akt-eNOS-NO信号通路介导的。(2) Chemerin可能是以后研究子痫前期等血管疾病的重要靶点.