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中医复方效用的物质基础是目前中医药研究的热点领域。中医复方组成是其效用的基础,从药味及化学组分及成分的角度探查中医复方物质基础是当前该领域的重要研究思路之一。由于中医复方功用内涵的不确定和其药理作用的多向性及化学构成的复杂性,完全阐明中医复方的效用物质基础目前仍面临很多技术上困难。但选择具有确切药理作用的中药配伍药对,从化学与效应相关的角度探查药对中的化学部位及其配伍与效用的关系,以获得影响药对效用的主要或关键化学部分是可能的。中医经典名方“小柴胡汤”具有和解少阳的功效,临床被广泛用于多种疾病的治疗,现代药理研究证实该方具有多方面的药理作用。先前的小柴胡汤药群配伍与其效用关系的研究发现该方中柴胡-黄芩是其抗炎、退热、保肝等药理作用的关键配伍。本课题以小柴胡汤核心药对柴胡-黄芩及其水提液为切入点,在确认其具有保肝作用及有效部位的基础上,采用血清药理学与血清化学相结合的方法,考察了其有效部位含药血清的指纹图谱和保肝活性,通过分析谱效关系探查该药对保肝作用的物质基础。论文分为文献综述和实验研究两部分。文献综述部分从中药复方物质基础研究进展和柴胡、黄芩单味药及其药对的现代化学和药理研究进展二方面分别进行了综述。实验研究部分从柴胡与黄芩药材的质量控制、柴胡-黄芩药对保肝作用及其有效部位的初步探查、柴胡-黄芩药对保肝作用有效部位的追踪、柴胡-黄芩有效部位含药血清的体外保肝活性研究、柴胡-黄芩保肝有效部位及其含药血清指纹图谱研究、柴胡-黄芩有效部位的血清指纹图谱与保肝作用的相关性研究等六个方面进行了较为系统的研究。研究一:柴胡与黄芩药材的质量控制方法:采用HPLC法测定柴胡药材中柴胡皂苷a和黄芩药材中黄芩苷的含量。结果:实验用柴胡药材中柴胡皂苷a的含量为0.34%;实验用黄芩药材中黄芩苷含量为12.70%。结论:柴胡药材中柴胡皂苷a的含量达到柴胡药材的普通水平,药材合格;黄芩药材中黄芩苷的含量达到2005版《中国药典》中关于黄芩药材中黄芩苷的规定,药材合格。研究二:柴胡-黄芩药对保肝作用及其有效部位的初步探查方法:采用乙醇沉淀法将柴胡-黄芩药对水提液分为A、B、C、D四个化学部位,制备ABCD部位合并液。大鼠随机分为正常组、模型组、柴胡-黄芩水提液组(柴芩组)、部位A+B+C+D组(部位合并组)4组,每组10只。后二组分别以相当于生药10g?kg-1灌胃给予柴胡-黄芩水提液和部位ABCD合并液,连续给药5d,每天1次,正常组和模型组分别给予同体积的蒸馏水。于末次给药2h后,模型组、柴芩组、部位合并组按7mL? kg-1腹腔注射10%的CCl4/植物油溶液,正常组大鼠给予等量生理盐水;给药24h后,取血,测定血清ALT、AST的含量。结果:与正常组相比,模型组大鼠血清ALT及AST含量均显著升高(p<0.01);与模型组相比,柴芩水提液组和部位合并组的血清ALT及AST含量均显著降低(p<0.05或p<0.01);柴芩水提液组与部位合并组的血清ALT及AST含量无显著性差异(p>0.05)。结论:柴胡-黄芩水提液及ABCD部位合并液能明显降低CCl4急性肝损伤模型大鼠血清中ALT和AST,且两者作用相当。在A、B、C、D部位分离过程中,柴胡-黄芩药对中的保肝作用活性成分没有丢失。研究三:柴胡-黄芩药对保肝作用有效部位的追踪实验一、柴胡-黄芩部位及其配伍与保肝作用的关系方法:1)按L8 (2 7)正交表要求配伍柴胡-黄芩水提液中A、B、C、D各部位,得到1-8号部位配伍液。SD大鼠随机分为8组(正交配伍1-8组),每组5只,各组动物各按相当生药10g?kg-1灌胃给予相应的提取部位配伍液,连续给药5d,每天1次。于末次给药2h后,各组大鼠按7mL? kg-1腹腔注射10%的CCl4/植物油溶液,给药24h后,取血,测定血清ALT、AST的含量。2)大鼠随机分为正常组、模型组、柴芩组、最佳部位配伍组(通过正交实验分析确定的最佳部位配伍,最佳组)4组,每组10只。后二组分别以相当于生药10g?kg-1灌胃给予柴胡-黄芩水提液和最佳部位配伍液,连续给药5d,每天1次,正常组和模型组分别给予同体积的蒸馏水。于末次给药2h后,模型组、柴芩组、最佳组按7mL?kg-1腹腔注射10%的CCl4/植物油溶液,正常组大鼠给予等量生理盐水;给药24h后,取血,测定血清中ALT、AST的含量。结果:1)正交试验表明,C和D对模型大鼠血清ALT与AST均有不同程度地降低作用(p<0.05或接近0.05),其最佳部位配伍为C+D。2)与正常组比较,模型组大鼠血清中ALT及AST含量均显著升高(p<0.01);与模型组相比较,柴芩水提液组和最佳部位配伍组的血清ALT及AST含量均显著降低(p<0.05);柴芩水提液组与最佳部位配伍组的血清ALT及AST含量无显著性差异(p>0.05)。结论:部位C、D是柴胡-黄芩药对保肝作用的主要部位;C+D组能显著降低模型大鼠血清ALT与AST,其效应与柴胡-黄芩药对水提液相当。实验二、柴胡-黄芩有效部位再分离及其配伍的保肝作用方法:1)采用乙酸乙酯、正丁醇萃取及乙醇沉淀法将CD有效部位再次分离为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个化学部位,按L8 (2 7)正交表要求配伍各部位,得到1-8号部位配伍液。SD大鼠随机分为8组(正交配伍1-8组),每组6只,各组动物各按相当生药10g?kg-1灌胃给予相应的部位配伍液,连续给药5d,每天1次。于末次给药2h后,各组大鼠按7mL?kg-1腹腔注射10%的CCl4/植物油溶液,给药24h后,取血,测定血清ALT、AST的含量。2)大鼠随机分为正常组、模型组、柴芩组、最佳部位配伍组(通过正交实验分析确定的再分离最佳部位配伍,最佳组)4组,每组10只。后二组分别以相当于生药10g?kg-1灌胃给予柴胡-黄芩水提液和最佳部位配伍液,连续给药5d,每天1次,正常组和模型组分别给予同体积的蒸馏水,于末次给药2h后,模型组、柴芩组、最佳组按7mL?kg-1腹腔注射10%的CCl4/植物油溶液,正常组大鼠给予等量生理盐水,给药24h后,取血,测定血清ALT、AST的含量。结果:1)正交试验表明,Ⅰ和Ⅲ对模型大鼠血清ALT与AST均有不同程度地降低作用(p<0.05或接近0.05),其最佳部位配伍为Ⅰ+Ⅲ。2)与正常对照组比较,模型组大鼠血清ALT及AST含量均显著升高(p<0.01);与模型组比较,柴芩组和最佳组的大鼠血清ALT和AST含量均显著降低(p<0.05);与柴芩水提组比较,最佳组的大鼠血清ALT及AST含量无显著性差异(p>0.05)。结论:部位Ⅰ、Ⅲ是柴胡-黄芩药对保肝作用的主要部位;Ⅰ+Ⅲ组能显著降低模型大鼠血清ALT与AST,其效应与柴胡-黄芩药对水提液相当。研究四:柴胡-黄芩有效部位含药血清的体外保肝活性研究方法:1)大鼠灌胃给予柴胡-黄芩药对有效部位,制备1.5h含药血清,用15mmol/L CCl4复制BRL-3A大鼠肝细胞损伤模型,以细胞培养上清中的ALT和AST为指标,考察5%,10%,20%含药血清对该模型的保护作用,确定最佳血清浓度;2)制备正常血清以及给药后5min,15min,25min,50min,1.5h,2.5h,5h,8h (即1、2、3、4、5、6、7、8号)含药血清,BRL-3A大鼠肝细胞随机分为10组,依次为正常组,模型组和各含药血清组,除正常组外,其余各组用15mmol/L CCl4造模,以细胞培养上清中ALT和AST为指标,考察不同时间点含药血清对该模型的保护作用。结果:1)与正常组相比,模型组和各含药血清组细胞培养上清液中ALT和AST值均明显升高(p<0.01);与模型组相比,三个含药血清组中10%含药血清组的细胞培养上清液中ALT和AST值均明显降低(p<0.05),该浓度为最佳含药血清浓度。2)与正常组相比,模型组细胞培养上清液中ALT和AST值均明显升高(p<0.01);与模型组相比,5、6、7、8号血清组细胞培养上清液中ALT明显降低(p<0.01);5、6、7号血清组细胞培养上清液中AST明显降低(p<0.01或p<0.05)。结论:柴胡-黄芩药对有效部位给药后1.5h,2.5h,5h的含药血清对体外大鼠肝细胞损伤模型具有较好的保护作用。研究五:柴胡-黄芩保肝有效部位及其含药血清指纹图谱研究方法:采用HPLC法建立柴胡、黄芩药材,柴胡-黄芩有效部位,有效部位含药血清的指纹图谱,并与柴胡皂苷a,黄芩苷标准品及正常血清的指纹图谱进行比较。色谱条件:C18柱;流动相:乙腈-含0.15%磷酸的水二元梯度洗脱;检测波长:203nm;柱温:30℃;流速1ml/min。结果:建立了柴胡、黄芩药材,柴胡-黄芩有效部位,有效部位含药血清的指纹图谱。结论:比对发现,有效部位指纹图谱中大多数色谱峰来自黄芩,有效部位指纹图谱中柴胡皂苷a,黄芩苷特征峰均较原药材中相应峰高;含药血清指纹图谱中出现16个新增峰,其中有8个峰所表征的成分为有效部位中的原形成分。研究六:柴胡-黄芩有效部位的血清指纹图谱与保肝作用的相关性研究方法:采用HPLC法测定柴胡-黄芩药对有效部位给大鼠给药后5min,15min,25min,50min,1.5h,2.5h,5h,8h含药血清的指纹图谱,色谱条件同前。结合各含药血清的保肝作用活性,进行谱效相关性分析。结果:双变量相关分析发现,ALT值的变化与13、16号峰相关性较好(p<0.05),AST值的变化与8,9,11,16号峰的变化相关性较好(p<0.05);强迫引入进行回归分析表明,1,3,5,6,11,13,16号峰被引入(p<0.1);逐步回归分析表明,16号峰对ALT、AST的影响较大(p<0.05),其标准化回归系数分别为-0.83和-0.76。结论:柴胡-黄芩药对有效部位指纹图谱中,13和16号峰的表征成分为该药对保肝作用的有效成分,其中16号峰表征成分为该药对保肝作用的关键成分。