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柑橘褐斑病(Alternaria brown spot,ABS)是由交链格孢菌(Alternaria alternata)引起的一种真菌病害。该病害主要侵染橘及其杂交种,可贯穿柑橘整个生长期,且以新梢和幼果期为害最为严重,造成落叶落果、枝梢枯死,严重影响柑橘产量与品质。由G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCR)介导的cAMP信号转导途径是病原真菌中主要的信号转导途径之一,对病原菌的生长发育、形态建成和致病性等均有重要的调控作用。cAMP磷酸二酯酶可以有效调控胞内基础cAMP水平,因此对cAMP信号转导途径中磷酸二酯酶的作用机制研究成为近年的热点。本试验克隆了高亲和力磷酸二酯酶基因AaPDEH和低亲和力磷酸二酯酶基因AaPDEL,并通过基因敲除技术得到突变体从而对目的基因进行功能研究,主要研究结果如下:1.利用酿酒酵母pde1和pde2的蛋白序列作为参考,在柑橘褐斑病菌基因组全序列数据库中进行BLAST比对,得到了pde1和pde2的同源基因,分别命名为AaPDEL和AaPDEH。分析发现,AaPDEL与稻瘟病菌、酿酒酵母、白色念珠菌等病原真菌的L-PDE氨基酸序列相似性为18.5%~52.59%,在这些氨基酸序列中均包含Ⅱ型磷酸二酯酶的保守结构域。AaPDEH与稻瘟病菌、酿酒酵母、白色念珠菌等病原真菌的H-PDE氨基酸序列相似性为30.26%~69.59%,在这些氨基酸序列中均有依赖金属离子的磷酸水解酶的保守结构域“HD motif”。通过生物信息学分析对比,发现柑橘褐斑病菌、酿酒酵母中的pde具有很多相似性质,提示不同真菌之间存在功能保守性。2.本试验根据同源重组原理构建了AaPDEL和AaPDEH基因敲除盒,将融合DNA片段通过PEG介导转入柑橘褐斑病菌原生质体中,所得转化子经过抗性筛选、PCR和Southern blot验证最终得到目的基因缺失的突变体ΔAaPDEL,ΔAaPDEH。通过PEG介导的原生质体转化法将互补质粒插入到敲除突变体中,经过G418抗性筛选和PCR检测各确定了1株阳性互补突变体PDEL-CP和PDEH-CP。3.对柑橘褐斑病菌野生型、AaPDEL和AaPDEH突变体和回补菌株进行生物学功能测定,分析磷酸二酯酶基因的功能。结果显示,AaPDEL的缺失导致突变体的产孢量较野生型显著下降,漆酶活性发生变化,且在不同胁迫培养基上的生长速度也受到不同程度的抑制,AaPDEL突变体对寄主的致病性也降低。AaPDEH虽然与AaPDEL一样影响漆酶活性,但对该病菌的分生孢子、细胞壁完整性及致病性等无调控作用。