脱落酸传感器构建及其在黄龙病菌侵染柑橘中的检测应用

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柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是柑橘种植中为害最严重的病害之一,该病原属于革兰氏阴性细菌,主要通过柑橘木虱进行广泛传播。该病害的发生和扩散对柑橘产业造成了极大的经济损失。脱落酸(Abscisic Acid,ABA)是植物中普遍存在的植物激素,具有控制植株器官脱落,抑制植物生长的作用,并在受到不利环境胁迫下自身会产生防御和抵抗。鉴于脱落酸在柑橘生长发育过程中产生的重要生理作用及黄龙病菌侵染后所产生的抗逆性,因此加强对黄龙病的防治和脱落酸的检测工作对于柑橘产业的发展具有重大现实意义。为此,亟需发展出能够准确、快速定量的ABA检测方法。本文通过还原石墨烯(r GO)和海藻酸钠(SA)等纳米材料对电极进行修饰,并通过在电极表面修饰ABA的单克隆抗体来实现对ABA的检测,建立了ABA免疫传感器,使该传感器具备较好的选择性和灵敏性。进一步以黄龙病侵染的柑橘为研究对象,通过制备的ABA免疫传感器检测了黄龙病菌侵染下脐橙体内ABA的含量变化,并研究了ABA合成途径中关键酶的基因表达量的变化,结果与我们传感器的检测结果相符,从而证明了传感器的实用性。具体研究结果如下:(1)制备及鉴定感染黄龙病的脐橙样本本研究首先在北京市农林科学院种业装备部生物实验室内对脐橙进行黄龙病嫁接侵染,然后对疑似柑橘黄龙病样本进行采样,对采集的3份样品进行植物表型分析、及PCR测定,所得的统计数据显示,在扩增的3份疑似样本中,有2份材料出现了与阳性对照一致的目标条带,约为703 bp,表明所检样品感染了柑橘黄龙病,因此我们选择筛选出的阳性材料作为后续开展实验的样本。而另一份样品检测中并未出现特异性扩增的目的条带,与阴性对照结果一致,表明该植株未感染柑橘黄龙病或病菌浓度较低,目前还未能检测出。(2)制备高灵敏性、高稳定性的ABA免疫传感器通过在电极表面修饰r GO及SA,来增加传感器的检测性能,并优化r GO、SA、ABA抗体的浓度比例,分别选择了三者最优浓度为1.5mg/ml、1.25mg/ml、0.5mg/ml,根据ABA抗体和抗原的结合反应导致电极阻抗出现变化(△Z1-Z0)的相应原理,进行了ABA免疫传感器的构建。发现:这一传感器在10p M~1μM响应范围内与ABA浓度呈现线性关系,线性方程是y=103.46x+480.73,R2=0.99927,根据实际检测结果,检测下限为10p M。(3)黄龙病菌侵染后植物体中ABA的检测应用采用我们制备的电化学免疫传感器,对黄龙病菌侵染后柑橘样本中ABA含量进行测定,试验结果表明健康叶片和感病叶片的阻抗变化值(△Z1-Z0)分别是为72、823,这表明植物受到病菌侵染后,体内脱落酸的水平出现了显著的增强,和之前研究的结果具有较强的一致性。该检测方法为病害胁迫下植物激素水平的检测提供了有力借鉴。(4)柑橘体内脱落酸相关基因表达水平的研究Cit ZEP是脱落酸合成途径中关键酶的基因,我们在实验过程当中应用荧光定量PCR方法对脱落酸基因表达水平进行检测。结果表明,感染黄龙病植株中的Cit ZEP表达量增加。从而表明Cit ZEP表达量增加引起了脱落酸合成酶的增加,进而引起了脱落酸的增加。该结果与我们的电化学传感器的检测结果一致,证明了传感器的实用性。
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