本研究以体外拆卸与重组的方法对金属原子簇缺失的固氮酶进行研究为主，再次证实固氮酶突变体金属原子簇体外拆装的可行性，同时，通过体外重组证实了不含FeMoco的蛋白污染的具高纯度的CrFe蛋白与MnFe蛋白新型固氮酶存在的可能性，为新型固氮酶的存在提供新证据。纯化出CrFe蛋白与MnFe蛋白并对其特性进行初步研究，此外，还进行△nifZ Avl制备物晶体生长研究。因而研究不仅具有深广度，也具有创新性。 　　用阴离子交换树脂DEAE-52和Q-Sepharose，以及凝胶过滤S-200或S-300柱层析，从棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)nifZ基因缺失的突变株(DJl94)纯化出纯度大于90％的△nifZ钼铁蛋白(△nifZ Avl)制备物，从nifE基因缺失的突变株(DJ35)中纯化出纯度较高的△nifE钼铁蛋白(△nifE Avl)制备物，以及从在含Cr或含Mn的培养基中固氮生长的nifH基因缺失的突变株(UW3)纯化出CrFe蛋白和MnFe蛋白。并对高纯度的△nifZAvl制备物进行了晶体生长条件的优化研究。 　　我所在实验室首次证实从DJl94中纯化出的△nifZ Avl制备物为FeMoco含量正常(2个)，而P-cluster缺少一半(1个)的、失去一半活性的MoFe蛋白。在厌氧的条件下，用过量的邻菲哕啉(O-phenanthroline，O-phen)螯合其P-cluster中的Fe原子，经计算后，△nifZAvl分子大约失去8个Fe原子，即为构成一个P-cluster([8Fe-7S]簇)中所有的Fe原子。经Sephadex G-25厌氧柱层析P-cluster金属原子簇中的Fe原子与O-phen螯合，得到完全无活性的△nifZAvl 。但△nifZAvl，而不是未经O-phen处理的△nifZAvl，可在Av2-MgATP复合体存在的条件下被含钼重组液显著激活。 　　从△nifZAvl抽提的FeMoco可在体外激活完全缺失FeMoco而无活性的△nifE露Avl和从另一突变株UW45纯化的nifB<->Avl。这表明我们纯化的这两种蛋白的确为正常的缺失FeMoco的固氮菌突变株蛋白。在厌氧的条件下，过量的O-phen也可从这两种蛋白的P-cluster中螯合出Fe原子。经Seplladex G-25柱层析得△nifEAvl和nifB<->Avl，而不是未经O-phen处理的△nifEAvl和nifB<->Avl，在Av2-MgATP复合体存在条件下也为含钼、含铬和含锰重组液显著激活。 　　上述3种突变株蛋白的体外激活显然需要两个必需条件，即O-phen处理和在Av2及MgATP同时存在。前者也许使蛋白结构松散，而后者则可能使蛋白结构变成有利金属原子簇的组装和插入的构象。既然蛋白功能是以其结构为基础，那么这些蛋白经O-phen处理和在Av2及MgATlP同时存在条件下能为上述重组液激活就表明，这重组蛋白中已存在新合成P-cluster和分别含Mo、Cr和Mn的cofactor(辅因子)，即FeMoco、FeCrco和FeMnco。由于△nifE Avl和nifB<->Avl都为缺失FeMoco，因此，通过体外重组就有可能得到不含FeMoco的蛋白污染的具高纯的CrFe蛋白和MnFe蛋白等新型固氮酶。因而所得结果具有非常重要的意义。