水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus),主要由灰飞虱以不经卵方式传播。该病毒可侵染水稻、玉米和小麦,在侵染水稻后,导致植株的严重矮缩、多分蘖、结实率低等症状,造成严重的经济损失。RBSDV基因组是由10条dsRNA片段组成,按照其在PAGE上的迁移率由快到慢依次称为S1-S10。其中S5基因组含有2个ORF,ORF1编码P5-1蛋白,ORF2编码P5-2蛋白。P5-2是一种非结构蛋白,目前有研究表明,在本氏烟中P5-2蛋白定位于叶绿体中,但其功能尚不明确。本论文为了探究RBSDVP5-2的致病作用机理,我们构建了 P5-2过量表达拟南芥。RBSDVP5-2蛋白在野生型拟南芥中表达导致植株的严重矮缩,这表明P5-2是病毒的重要致病因子。利用酵母双杂交技术筛选水稻(日本晴)cDNA文库中与P5-2互作的水稻因子,结果显示P5-2与多个寄主因子互作,通过同源序列对比,预测功能分析,发现在酵母内与P5-2互作的寄主因子包括ZFP(TFⅡIA型锌指转录因子)、BBTI5(Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂)、R3H(水稻功能未知蛋白)等。针对筛选出的水稻因子,通过酵母双杂交技术验证ZFP、BBTI5、R3H和P5-2蛋白在酵母内的互作。为了进一步验证P5-2与水稻因子在植物体内互作,我们构建一系列荧光标记或Luc(luciferase)植物表达载体。通过浸润本氏烟,荧光素酶互补实验(Split-luciferase)验证P5-2与水稻转录因子ZFP、蛋白酶抑制剂BBTI5、RNA结合蛋白R3H在植物细胞内存在互作;用激光共聚焦显微镜观察P5-2蛋白与互作因子的亚细胞定位(Co-localization),发现RBSDV P5-2在细胞核中与水稻转录因子ZFP互作,在细胞质与蛋白酶抑制剂BBTI5互作,在细胞质和细胞核中与R3H互作。为了进一步分析以上P5-2互作水稻因子在抗病毒中的作用,本研究利用CRISPR-cas9基因编辑技术构建P5-2互作因子突变体水稻。通过农杆菌介导的转化方法获取水稻T0代突变体植株,对水稻ZFP、BBTI5、R3H CRISPR-cas9敲除突变体植株进行分子检测,结合靶标序列测序结果,我们获得ZFP、BBTI5、R3H敲除T0代纯和突变体植株。用带RBSDV灰飞虱接种ZFP、BBTI5突变体植株,qRT-PCR定量分析病毒含量,结果表明,ZFP、BBTI5 CRISPR-cas9 T1代突变体植株与野生型植株相比,病毒含量和发病率明显较低,这些结果表明病毒P5-2水稻互作因子ZFP、BBTI5在水稻抗病毒中起着重要的作用。另外,本研究需要用到受水稻黑条矮缩病毒的水稻病株,因此为了快速检测植物中是否携带病毒以此来加快实验进程,本研究建立了重组聚合酶扩增技术(RPA),并且通过对反应最适温度等条件的探索,表明37℃的温度反应20 min后即可观察到明显的检测结果,证明了 RPA检测RBSDV的方法更加简便、快速、高效,适合用于田间和实验室检测水稻RBSDV。本论文研究结果可为解析RBSDVP5-2与水稻寄主因子ZFP、BBTI5的互作机制、病毒的致病机理等研究提供理论基础。