研究背景及目的近年来乳腺癌发病率不断上升,严重威胁女性生命健康。早期诊断及治疗是提高乳腺癌生存率的关键。但是临床上目前尚缺乏诊断乳腺癌的敏感特异的方法。放射性核素显像可在分子水平实时无创性监测疾病发生发展,可在疾病早期提供功能代谢方面改变的信息。因此寻找新型分子靶点进行放射性核素分子显像研究有可能为乳腺癌的分子诊断和治疗提供新的手段。新近研究表明,To1]样受体家族(TLRs)在肿瘤细胞表达,其中Toll样受体5(TLR5)在胃肠道肿瘤、前列腺癌、卵巢癌和乳腺癌等高表达,与肿瘤发生发展密切相关。新近报道,TLR5的特异激动剂-细菌鞭毛蛋白(Flagellin)可以抑制乳腺癌细胞的增殖和生长,因此TLR5有可能成为监测和治疗乳腺癌的分子靶点。本论文在证实人乳腺癌细胞系MCF-7表达TLR5的基础上,成功制备基因重组鞭毛蛋白(rFliC),并用放射性核素131I标记rFliC,研究了标记率、放化纯、稳定性及MCF-7细胞对该标记物的摄取与流出特征。建立荷乳腺癌小鼠模型,探讨I-rFliC在正常小鼠及荷瘤小鼠体内的生物学分布特点及肿瘤靶向性,旨在为乳腺癌的早期诊断探讨新的靶向制剂。研究方法1、利用含有基因重组鞭毛蛋白的质粒—GST-FliC-B.pseudomallei pGEX4T-2诱导表达rFliC,SDS-PAGE鉴定其诱导表达情况。纯化后,蛋白质印迹法(Western Blot)鉴定其特异性。2、利用免疫荧光技术检测人乳腺癌细胞系MCF-7中TLR5的表达情况。3、用不同浓度的rFliC刺激MCF-7细胞,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western Blot分别从从基因及蛋白水平检测TLR5的表达情况。4、用不同浓度的rFliC刺激MCF-7细胞,用CCK-8法检测其对细胞增殖的影响。5、四氯二苯基苷脲(Iodogen)法131I标记rFliC,纸层析法检测放射性化学纯度,三氯醋酸沉淀法检测131Ⅰ-rFliC在血清和PB中的稳定性。6、研究MCF-7细胞对131Ⅰ-rFliC摄取及流出状况。7、建立MCF-7荷瘤鼠模型,注射131Ⅰ-rFliC后,观察其在正常小鼠及荷瘤小鼠体内生物学分布及肿瘤靶向性。研究结果1、成功诱导表达rFliC并进行了鉴定。结果证实纯化的rFliC具有良好的生物学活性。2、免疫荧光分析结果表明MCF-7细胞表达TLR5蛋白,TLR5抗体可与乳腺癌MCF-7细胞特异性结合。3、RT-PCR及Western Blot结果均显示,与对照组相比,加入rFl iC0.01μg/mL即可明显抑制TLR5mRNA及蛋白表达；随着rFliC浓度的增加,MCF-7细胞TLR5mRNA及蛋白表达均逐渐减弱。4、用CCK-8方法检测细胞增殖,结果显示：随着rFliC浓度的增加,MCF-7在450nm的吸光度呈下降趋势,表明rFliC抑制乳腺癌细胞的增殖,且呈剂量依赖方式。5、用Iodogen放射性碘标记rFliC,标记方法简便迅速,1Ⅰ-rFliC稳定,标记率达95.19%；纸层析法测得放化纯为96.46%；131Ⅰ-rFliC血清中稳定性高于PB中。6、MCF-7对131Ⅰ-rFliC的摄取随着时间的延长增加,6h后进入平台期；MCF-7对131Ⅰ-rFliC的流出随着时间的延长而增加,30min后流出趋于稳定。7、成功制备了乳腺癌MCF-7荷瘤小鼠模型。体内生物学分布研究显示131Ⅰ-rFliC主要通过肝、肾代谢,其他器官放射性较低,肿瘤部位的放射性明显高于对侧肌肉组织。24h靶/非靶(T/NT)放射性比值为7.09。8、磷屏放射自显影图像表明,注射131I-rFliC后乳腺癌荷瘤鼠的肿瘤部位放射性浓聚明显,肿瘤靶向性明显,可获得清晰放射自显影像,与生物学分布结果一致。研究结论乳腺癌细胞MCF-7高表达TLR5,基因重组鞭毛蛋白(rFliC)可以明显抑制乳腺癌细胞TLR5的表达及增殖,并呈浓度依赖方式。131I-rFliC标记简单,生物学性质稳定,标记率高,在荷乳腺癌小鼠中肿瘤靶向性分布明显,提示其可作为一种新型分子探针监测乳腺癌的发生发展,因此对于乳腺癌的诊断可能具有潜在应用价值,并有望用于其他TLR5表达阳性的肿瘤显像,值得进一步深入研究。