高温逆境是棉花生殖生长的主要限制因子之一。棉花有性生殖过程对高温极为敏感。在花蕾发育及开花过程中,高温往往导致棉花雄蕊发育迟缓、形态畸形、花粉败育或育性下降,影响有性生殖和受精过程,蕾铃脱落率升高,造成产量降低。随着全球气温升高,短时高温天气频繁发生。特别是在中国长江流域,每年夏季日最高温度超过35℃以上的高温天气频繁发生,此阶段正是棉花开花、结铃的盛期,高温常导致棉花产量与品质降低。筛选和培育耐高温的陆地棉品种对于棉花生产极为迫切。目前国内外对陆地棉耐高温的筛选主要集中在叶片细胞膜稳定性、渗透调节物、抗氧化系统代谢物和光合系统等方面,筛选参数多而不统一,且这些筛选参数只是陆地棉某一代谢物特性的体现。棉花蕾的发育及授粉受精过程中耐高温研究尚少见报道。开展陆地棉生殖系统的耐热性研究对于棉花生产具有重要意义。本文目的是利用液体培养基培养花粉并测定萌发率,研究蕾发育过程中温度逆境对花粉萌发的影响,建立棉花蕾发育过程中雄蕊及花粉耐高温筛选技术体系,揭示棉花花粉耐高温机理,克隆棉花耐高温相关的HSP基因并分析其功能。根据本课题组对220份陆地棉品种花粉耐热性鉴定的结果,本研究选出9650短果枝、苏棉12号、盐抗1107等耐高温陆地棉品种及苏棉16号感高温陆地棉品种作为研究材料,研究了蕾发育过程中的高温和不同培养温度对花粉萌发率的影响、耐高温与感高温陆地棉品种花粉萌发率的杂种优势、陆地棉雄蕊中热激蛋白基因克隆及表达特性,建立了陆地棉雄蕊耐热性筛选方法,为探索耐热机理和选育耐热品种提供了理论基础。主要研究内容和结果如下1.陆地棉花粉耐高温研究连续28天测定4个品种花铃期的花粉粒在培养温度30℃、33℃、35℃、37℃和39℃下的萌发率,分析了高温前期、高温期和高温后期的花粉萌发率变化规律与日高温间的关系,以及花粉粒萌发率变化规律与33℃和35℃以上日高温持续时间的关系,培养温度与花粉萌发率的关系。结果表明,33℃以上的日高温影响棉花雄蕊的发育,高温持续时间越长影响越大,雄蕊形成的花粉粒活性越低,花粉萌发率越低。高温前期与后期,花粉粒萌发率存在显著差异,日高温是导致花粉萌发率变化的主要因素。花粉萌发率随着培养温度升高而降低,花粉离体萌发的培养温度在30-35℃时,花粉萌发率下降幅度最大,品种间差异最大,35℃的培养温度是筛选陆地棉花粉耐热的合适温度。培养温度35℃下花粉萌发率较30℃萌发率的下降率小于41%可认为为耐高温品种,大于41%为感高温品种。这一指标可用于棉花雄蕊耐高温的筛选。2.陆地棉花粉耐热性杂种优势研究在高温前期、高温期和高温后期,测定了耐高温品种、感高温品种及F1代的花粉萌发率。结果表明,陆地棉花蕾发育受田间高温影响后,耐高温品种与感高温品种杂交F1代花粉粒离体萌发率呈现明显的中亲优势。高温前期,杂交F1代离体花粉粒在培养温度35℃下呈现较高的中亲优势。受高温影响后,杂交F1花粉活力有较强的恢复能力,在30℃和35℃培养温度下,花粉萌发率较高,中亲优势较明显。3.陆地棉花粉耐热性与花药结构变化及花粉粒内细胞器关系的研究高温处理耐高温和感高温陆地棉品种,观测了高温前后花粉萌发率、花药结构和花粉粒超微结构。结果表明,高温逆境下,感高温品种苏棉16号的花药内畸形花粉粒数量大于感高温9650短果枝,苏棉16号花粉粒内部的液泡数量增多、淀粉粒减少,苏棉16号花粉粒内畸形线粒体和内质网数量高于9650短果枝,苏棉16号花粉萌发率小于9650短果枝,9650短果枝花粉粒的耐热性大于苏棉16号。花粉粒耐热性可能与花粉形成过程中花药结构有关,与花粉粒内部的液泡、淀粉粒、线粒体和内质网等细胞器相关。受高温胁迫后,花粉粒耐热性决定了花粉粒萌发率的高低。高温胁迫下,花药结构和花粉超微结构与花粉粒耐热性密切相关。4.陆地棉热激蛋白基因的克隆与功能分析采用RACE法克隆了陆地棉热激蛋白sHSP2基因(GenBank收录号为：JQ756321)。sHSP2属于细胞质Ⅱ类热激蛋白基因,与细胞的耐热性密切相关。陆地棉叶片和雄蕊中热激蛋白sHSP2基因表达量和表达模式不同。sHSP2在叶片中的表达呈现先升高后降低再升高的双峰模式,高温胁迫1h、24h表达量达到最大,sHSP2可能在在防止高温下蛋白质变性及聚集沉淀,减缓高温胁迫对陆地棉植株的伤害方面起重要作用；sHSP2在雄蕊(花药)中的表达呈现单峰模式,高温胁迫12h表达量达到最大,sHSP2可能在减缓高温胁迫对陆地棉雄蕊的伤害方面起重要作用；12h可能是棉花雄蕊对35℃高温胁迫耐受的阈值。对转sHSP2基因拟南芥功能分析结果表明,高温胁迫下转sHSP2基因可以提高拟南芥植株叶绿素和热激蛋白含量,降低丙二醛的产生,提高了植株的耐热性。采用RACE法克隆了陆地棉热激蛋白HSP90基因(GenBank收录号为：JX843808)。HSP90属于HSP90基因家族,与细胞信号传导、蛋白转运相关。陆地棉叶片和雄蕊中热激蛋白HSP90基因表达量和表达模式不同。HSP90在叶片中的表达呈现先升高后降低再升高的双峰模式,高温胁迫1h、24h表达量达到最大,该基因可能在减缓高温胁迫对陆地棉叶片的伤害中起重要作用。HSP90在雄蕊(花药)中的表达呈现单峰模式,高温胁迫12h表达量达到最大,HSP90可能对减缓高温胁迫对陆地棉雄蕊的伤害起重要作用；12h可能是雄蕊对35℃高温胁迫耐受的阈值。对转HSP90基因拟南芥功能分析结果表明,高温胁迫下转HSP90基因可以提高拟南芥植株叶绿素和热激蛋白含量,降低丙二醛的产生,提高了植株的耐热性。本研究的结论是35℃的培养温度可以作为陆地棉花粉耐热筛选温度。41%的花粉下降幅度可以作为耐热材料筛选的参考指标。35℃以上的培养温度下,花粉具有较明显中亲优势。花粉的耐热性与花药的结构、花粉粒内部的细胞器及花粉粒发育过程中HSP表达相关。陆地棉sHSP2和HSP90基因可能与陆地棉耐热性相关。sHSP2和HSP90基因的过量表达可以提高拟南芥植株的耐热性。