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背景:乳腺癌是导致女性死亡的主要恶性肿瘤,原因在于缺乏专一而有效的治疗靶点,因而寻找特异的治疗靶点是乳腺癌研究中的一大难题。lncRNAs是一组不编码蛋白质的转录体,长度大于200个核苷酸,lncRNA在细胞周期和分化调控等众多生命活动中发挥重要作用,如调控细胞结构的完整性,控制的亚细胞定位,和表观遗传修饰等。长链非编码RNA功能的发挥通常依赖于互作蛋白,如lncRNA TERRA就是通过与hnRNPA1互作,实现细胞的永生化。lncRNA MEG3(Maternally Expressed Gene3)是一种母系遗传的印记基因,位于人类染色体14q32,在人体多种正常组织中表达,在脑和垂体高表达,而在非小细胞肺癌和乳腺癌等肿瘤细胞中不表达或低表达,在癌细胞系如HeLa,H4和CH157-MN中重新表达MEG3,均可抑制细胞增殖。此外MEG3能够促进肿瘤抑制基因p53蛋白表达水平,增强p53与其靶基因启动子的结合。MEG3可通过刺激p53依赖的转录在体外和体内诱导细胞凋亡。近年来在肺癌细胞中有研究者运用ChIRP技术检测到MEG3可以招募PRC2复合体的组件JARID2及其靶基因,形成DNA-RNA的复合体,实现H3K27的甲基化,进而影响EMT进程。在本文中我们建立并优化了在乳腺癌中lncRNA MEG3胞内结合蛋白的亲和纯化技术,结合质谱(MS-LC)技术,筛选出lncRNA MEG3的相互作用蛋白。并且在乳腺癌细胞中通过RNA-seq技术鉴定过表达与敲低MEG3之后下游靶基因的变化,聚类分析后筛选出与表型相关的靶基因,通过检测MEG3的结合蛋白以及其下游靶基因,对于进一步明确MEG3在乳腺癌中发挥抑制细胞增殖,迁移以及克隆形成的作用机制有着重要的意义,并为lncRNA在癌症发生发展中的机制研究提供借鉴。方法:1.利用RT-PCR的方式,检测MEG3在人胚肺成纤维细胞MRC5与不同乳腺癌细胞系(T47D,HCC1954,MDA-MB-231,MCF7)中的表达情况。2.利用Lenti-X Tet-On 3G诱导表达系统,构建Plvx-TRE3G-MEG3以及Plvx-TET3G两个质粒,共转染MDA-MB-231以及MCF7乳腺癌细胞嘌呤霉素药筛实现MEG3稳定过表达。3.本文通过CRISPRi技术,设计了靶定MEG3启动子区的sgRNA,sgRNA的质粒上还带有KRAB区域,当dCSA9结合靶定区后,KRAB发挥转录抑制的作用,从而在转录水平上实现MEG3在正常乳腺上皮细胞的稳定敲低。4.利用MTT检测稳定过表达以及敲低MEG3对细胞增殖的影响;利用划痕实验检测稳定过表达以及敲低MEG3对细胞迁移的影响;利用克隆形成实验检测稳定过表达以及敲低MEG3对细胞克隆形成等生物学功能的影响5.利用RNAseq检测MEG3过表达或者敲低后下游靶基因的变化。6.利用优化后的lncRNP亲和纯化技术,筛选出MEG3结合蛋白:SDS-PAGE胶银染后得到相较于反向以及空白对照组差异明显的条带,将每个样品的条带分别送样后,将差异条带单独切出送样,结果交叉分析后得到关键蛋白。7.通过过表达与敲低MEG3细胞株的下游靶基因的交叉分析(维恩分析),筛选出过表达细胞株共同上调或共同下调的靶基因以及过表达细胞株与敲低细胞株比较中上调或下调趋势相反的靶基因,聚类分析(GO分析等)后从中挑出与迁移相关的关键基因做之后的研究。结果:在乳腺癌细胞株MCF7,MDA-MB-231稳定过表达MEG3以及在乳腺上皮细胞MCF10A中利用CRISPR-dCAS9稳定敲减MEG3,细胞功能试验表明过表达MEG3能抑制细胞的增殖、迁移以及克隆形成的能力,敲低MEG3后能明显的促进细胞迁移。然后通过RNA-seq技术鉴定过表达与敲低MEG3之后下游靶基因的变化,聚类分析后筛选出与迁移表型相关的8个可能的靶基因,并做进一步研究。最后建立并优化了在乳腺癌中lncRNA MEG3胞内结合蛋白的亲和纯化技术,结合质谱(MS-LC)技术,筛选出lncRNA MEG3的相互作用12个关键蛋白。结论:本研究结果表明已初步确认了过表达MEG3能抑制细胞的增殖、迁移以及克隆形成的能力,敲低MEG3后能明显的促进细胞迁移;通过RNA-seq技术筛选MEG3的下游靶基因,聚类分析后筛选出与迁移表型相关的8个可能的靶基因。优化了上游结合蛋白的亲和纯化技术,筛选到12个与可能与MEG3结合的关键蛋白,为lncRNA MEG3在乳腺癌的发生发展的中的机制奠定研究基础。