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第一部分冠心病患者microRNA-155与Th细胞分化的相关性目的观察CHD患者外周血中炎症相关的miRNAs的表达情况和Th细胞亚群的分化情况,并分析二者之间的关系。方法收集稳定型心绞痛(stable angina, SA)患者、不稳定型心绞痛(unstable angina, UA)患者、AMI患者及性别、年龄与其无差异的胸痛综合征(chest pain syndrome, CPS)患者各15-16例。分别采集每位患者外周血8mL,离心收集血浆,密度梯度法离心获取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)。用Trizol LS和Trizol试剂分别提取外周血血浆及PBMCs中的RNA,再用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcription and quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)的方法检测炎症相关的miRNAs的表达情况；用流式细胞术的方法检测患者外周血PBMCs中Th细胞亚群的比例；用荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization, FISH)及免疫组化的方法分别显示PBMCs中miR-155和Th17细胞的分布情况。结果与CPS患者PBMCs中相应miRNAs的表达水平相比,UA和AMI患者PBMCs中miR-21和miR-146a的表达水平均升高约2倍(p<0.01),miR-155的表达水平则降低约50%(p<0.01),而miR-125b和miR-31的表达水平无明显变化(p>0.05)。除了miR-21,上述其他miRNAs在UA及AMI患者血浆中的表达情况与它们在PBMCs中的表达情况基本一致(p>0.05)。但与CPS患者血浆中miR-21的表达量相比,AMI患者血浆中其表达量升高约6倍(p<0.01),而UA患者血浆中其表达量无明显变化(p>0.05)。然而,SA患者外周血中上述miRNAs的表达水平与CPS患者相比无明显差异(p>0.05)。进一步我们分析了CHD患者PBMCs中各个Th细胞亚群的比例。结果显示,与CPS患者相比,UA和AMI患者PBMCs中Thl和Th17细胞在CD4+T细胞中的比例明显升高(p<0.01),Treg细胞的比例明显降低(p<0.01),而Th2细胞的比例则无明显变化(p>0.05)。进一步,用Spearman’s相关性分析法分析发现,ACS患者(包括UA及AMI患者)PBMCs中miR-155的表达与Th17细胞的比例呈高度负相关(r=-0.896,p<0.01)。深入研究还发现,miR-155和IL-17A可共表达于UA及AMI患者PBMCs中相同细胞内。结论部分炎症相关的miRNAs在ACS患者外周血中呈特异性表达,且miR-155的表达水平与Th细胞的分化密切相关。第二部分MicroRNA-155诱导CD4+T细胞分化的作用机制目的明确miR-155如何调节CD4+T细胞亚群(包括Th1、Th2、Th17及Treg细胞)的分化及其特异性转录因子和细胞因子的表达,并明确miR-155主要作用的靶基因及其主要调节的信号通路。方法取BALB/c小鼠脾脏,研磨并密度梯度法离心获取脾脏单个核细胞；磁珠分选获得高纯度CD4+T细胞(纯度>95%)；用nucleofection的方法将寡聚核苷酸(包括pre-miR-ctrl、pre-miR-155、anti-miR-ctrl、anti-miR-155、SOCS1-TPmiR-155和control-TPmiR-155)转入CD4+T细胞；用特异性抗体活化并极化CD4+T细胞；用流式细胞术检测CD4+T细胞亚群的比例；用qRT-PCR的方法检测相关转录因子的表达情况；用qRT-PCR和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测相关细胞因子的表达情况；用免疫印迹分析(Western boltting)检测靶基因及相关信号通路中重要蛋白的表达情况。结果当miR-155过表达时,Th17及Treg细胞在CD4+T细胞中的比例及其标志性转录因子孤独受体(retinoic acidrelated orphan receptor γt, ROR-γt)和叉状头／翅膀状螺旋转录因子(Fork head/winged helix transcription factor, Foxp3)的表达明显高于对照组(p<0.05)。反之,当miR-155的表达被抑制时,Th17及Treg细胞的比例及其标志性转录因子的表达则明显低于对照组(p<0.05)。同时我们发现,当miR-155过表达时,Th17细胞的功能性细胞因子白介素-17A (interleukin17A, IL-17A)的表达也明显升高(p<0.05),而miR-155被抑制后,其表达则明显降低(p<0.05)。然而,miR-155对Treg的功能性细胞因子IL-10及肿瘤生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)的表达无明显调控作用(p>0.05)。进一步研究发现,酪氨酸蛋白激酶-信号传导和转录激活因子(Janus kinas/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信号通路的负反馈抑制因子,即细胞因子信号转导抑制因子1(suppressor of cytokine-signaling-1, SOCS1)是miR-155的重要靶基因。在CD4+T细胞分化过程中,miR-155通过抑制SOCS1的表达而间接激活JAK/STAT信号通路,进而促进Th17及Treg细胞的分化,并影响Th17的功能。我们的研究还证实,当miR-155过表达时,Thl的标志性转录因子和功能性细胞因子,即T细胞转录因子(T-box expressed in T cells, T-bet)和干扰素-γ (interferon-γ, IFN-γ)的表达明显高于对照组,而Th2的标志性转录因子和功能性细胞因子,即GATA结合蛋白(GATA-binding protein-3, GATA3)和IL-4的表达则明显低于对照组(p<0.05)；而当miR-155被抑制后,Thl和Th2的标志性转录因子和细胞因子的表达与上述情况恰好相反(p<0.05)。结论MiR-155可促进促炎性CD4+T细胞亚群Thl及Thl7细胞的分化及其功能的发挥；抑制抑炎性CD4+T细胞亚群Th2细胞的分化及其功能的发挥；而对Treg细胞,miR-155可促进其分化,但并不影响其功能的发挥。而且miR-155主要通过抑制JAK/STAT信号通路的负反馈抑制因子SOCS1的表达而调节Th17和Treg细胞的分化。总之,miR-155可通过抑制SOCS1的表达而诱导CD4+T细胞分化的失衡。第三部分MicroRNA-155诱导RAW264.7细胞向DC细胞分化目的明确miR-155如何调控RAW264.7细胞表面分子及细胞因子的表达。方法培养RAW264.7细胞,用Attractene Transfection Reagent将寡聚核苷酸(包括pre-miR-ctrl、pre-miR-155、anti-miR-ctrl及anti-miR-155)转入RAW264.7细胞；用不同浓度的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, oxLDL)刺激细胞；用qRT-PCR的方法检测miR-155的表达量；用流式细胞术检测表面标记物的表达量；用qRT-PCR及ELISA的方法检测细胞因子的表达量。结果用LPS刺激RAW264.7细胞24hrs后,miR-155的表达量比对照组升高约200倍(p<0.01),而用oxLDL刺激细胞24hrs后,其表达量仅升高约2倍(p<0.05)。进一步研究发现,在LPS或oxLDL活化的RAW264.7细胞中过表达miR-155后,其表面分子人类主要组织相容性复合体-I(Major histocompatibility complex-Ⅰ, MHC-Ⅰ)、MHC-Ⅱ、 CD86及CD83及细胞因子IL-6、IL-12及IL-lb的表达均升高(p<0.05),相反,当miR-155的表达被抑制时,上述表面分子和细胞因子的表达则降低(p<0.05)。此外,在oxLDL活化的RAW264.7细胞中,miR-155诱导表达的表面分子还包括CD36(p<0.01)。结论用LPS和oxLDL刺激RAW264.7细胞均可使miR-155的表达水平升高,而高表达的miR-155可进一步促进RAW264.7细胞表面分子的表达和促炎性细胞因子的分泌,而这些分子不仅是DC细胞成熟的标志,而且是其发挥抗原提呈作用所必需的。总之,上述结果表明,miR-155可诱导RAW264.7细胞向DC细胞转化,而这种转化对免疫炎症反应和AS的进展都起着至关重要的作用。