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植物的胚胎后发育取决于分生组织的活性,因此分生组织中细胞的命运对植物的发育和株型至关重要。转录抑制因子通过与其他蛋白的互作,从而对基因的表达起相应的抑制作来调节基因的功能。目前已报道的植物转录因子包括拟南芥TOPLESS (TPL),玉米RAMOSA1 ENHANCER LOCUS2(REL2)和水稻ABERRANT SPIKELET AND PANICLEI(ASP1)均属于转录抑制因子TUP1家族。这类转录因子能调控发育及生理反应的多个方面,如穗、枝梗和小穗等的发育,同时对叶腋分生组织的维持起重要作用。本研究以普通小麦作为研究材料,通过电子克隆及PCR克隆等方法,分离得到小麦TaASP1基因序列,并对该基因的表达模式及功能进行了初步的研究,为深入解析该基因在小麦形态发育和环境应答等方面的作用奠定基础。本研究的主要结果如下：1. 以水稻OsASP1基因(GenBank登录号：AK111830)的cDNA序列为模板,Blast检索NCBI中小麦EST数据库,选取同源性较高的7对EST序列进行拼接,获得包含完整开放阅读框(ORF)的3591bp序列；并以该序列为模板设计4对相互重叠特异引物,利用中国春cDNA进行PCR克隆,每对引物均获得单一条带,回收克隆测序分别得到1284bp.1098bp.1072bp和1500bp序列,经拼接得到全长3527bp的序列,经与OSASP1基因比对,相似度为89%,其中ORF全长为3402bp,编码1133个氨基酸残基,具有转录抑制因子TPL的特征区域,表明克隆所获得的序列为小麦转录抑制因子序列,命名为TaASP1。2.基于克隆获得的cDNA序列,分别在外显子区设计8对相互重叠引物,利用野生一粒小麦(T.boeoticum,AA)P110474分段扩增TaASP1基因DNA序列,每对引物均获得单一条带,测序分别获得1162bp.1355bp.1163bp. 1244bp.1142bp.920bp.1331bp和1064bp的8段序列序列,经拼接获得全长8076bp的序列,通与克隆得到的cDNA序列比表明,该基因包含3402bp的外显子区和4674bp的内含子区,含有25个外显子和24个内含子。3.将从野生一粒小麦PI10474克隆得到的小麦TaASP1基因与其他植物中TPL亚家族基因进行蛋白序列比对,小麦TaSP1与水稻ASP1、玉米REL2和拟南芥TPL的蛋白序列相似性分别为92.5%、90.73%和65.51%；小麦TaSP1具有TPL转录因子家族的LisH、CTLH和WD40保守结构域；小麦TaSP1的LisH区域与玉米REL2和拟南芥TPL完全相同,与水稻ASP1的相似性达到96.77%,小麦ASP1蛋白的CTLH区域与水稻ASP1、玉米REL2和拟南芥TPL的相似性分别为98.28%、98.28%和82.76%。4.利用前文中设计的引物DF2/DR2以21套中国春缺体-四体系进行PCR扩增,结果在24个材料中均能扩增出条带。利用前文中从野生一粒小麦中克隆得到的DNA序列,在小麦基因组数据库URGI检索,将TaASP1基因定位于7A、7B和7D染色体上；序列比对分析表明在始密码子上游700bp处,相对于7A和7B,7D位点存在100bp的缺失,以此缺失为模板设计特异引物TF/TR,对21套中国春缺体-四体材料进行PCR扩增,结果在N7DT7B中仅扩增到一条带,而在其他材料中均扩增到两条带,进一步表明小麦TaASP1基因位于7A、7B和7D染色体上。5.以ACTIN基因为内参,以QF/QR作为目的基因引物,采用荧光定量PCR(QRT-PCR)分析了TaASP1基因在普通小麦中国春、10-A和E89抽穗期和孕穗期的穗、茎和叶片等部位的表达模式。结果表明,TaASP1基因在中国春灌浆时期的穗、茎、叶、种子和根部均有表达,但是在穗和茎中的表达量相对较高；在穗发育的不同阶段,该基因在穗部的表达相对比较稳定,在0.5-3.0cm时,表达量持续的增高,3.0-6.0cm时,表达量稍微有所下降；此外,10-A在穗、茎和叶三个部位的表达量均稍高于中国春和E89,茎部的表达量明显高于穗和叶,推测小麦TaASP1基因可能在茎节伸长生长和穗发育中具有重要作用。6. 以小麦TaASP1基因的cDNA序列起始密码子后的1248bp包含信号肽序列为目标序列,设计特异引物通过PCR扩增在序列两端分别添加BglⅡ和spe Ⅰ双酶切位点,经双酶切处理后插入经同样双酶切处理过的真核表达载体pCAMBIA1302的35S启动子和GFP中间,构建的真核重组质粒35S：TaASP1-GFP。将构建的新载体利用基因枪轰击洋葱表皮细胞,在475nm蓝光激发下,对照组原始质粒pCAMBIA1302在细胞膜、细胞质和细胞核中均可以检测到绿色荧光,而新构建的重组质粒35S:TaASP1-GFP只有在细胞核中检测到了绿色荧光,表明小麦TaASP1基因亚细胞定位于细胞核中。7.以中国春基因组DNA为模板,以小麦TaASP1起始密码子ATG上游1557bp的序列作为目标序列,设计特异引物通过PCR扩增在序列两端分别添加HindⅢ和BamhⅠ双酶切位点,经双酶切处理后纯化,同时将真核表达载体pBI121的CaMV35S用HindⅢ和BamhⅠ内切酶剪切掉,替换成TaASP1基因的启动子序列,新构建重组质载体TaASP1:GUS,转化进入农杆菌LB4404后去侵染烟草的幼嫩的叶片。检测具有阳性的转基因烟草经GUS染色后,在转基因烟草的根、茎、叶和叶梗中均被染成蓝色。证明TaASP1基因启动子转化成功并在多个组织中均有表达。