基于免疫磁分离和CdZnTe量子点的李斯特菌荧光免疫检测方法的研究

来源 :广东工业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:Liuyuly
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存在于食物中的李斯特菌(L.monocytogenes)引起的侵入性感染时常发生,婴儿和孕妇等免疫功能低下人群感染后一般会导致败血症和脑膜脑炎。相较于其他食源性致病菌,李斯特菌致病程度更严重,在某些暴发期间致死率接近30%。因此,李斯特菌的灵敏、特异和快速检测对于确保食品安全和公众健康至关重要。细菌检测的金标准是平板菌落培养计数法,但这种方法既耗时又费力。传统方法的局限性促进了各种新兴病原菌检测技术和方法的发展,其中,荧光生物传感方法由于其定量性质和快速响应在检测李斯特菌中呈现出巨大的应用潜力。在本文中,首先培养目标致病菌并制备其免疫原,接着分别免疫豚鼠和新西兰大白兔,获得识别元件——抗李斯特菌抗体。接着通过正辛酸和饱和硫酸铵梯度盐析法纯化血清和获得特异性抗体,利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和BCA蛋白检测试剂盒鉴定抗体的纯度和相对分子质量,并采用酶联免疫吸附实验和FITC免疫荧光染色实验分析抗体的效价和特异性。第二步,合成超小顺磁性且在水溶液中分散性好的Fe3O4磁性纳米粒子(Fe3O4 NPs)和具有长波荧光发射的CdZnTe量子点(CdZnTe QDs)。将制备的豚鼠抗体通过静电作用结合到磁性纳米粒子上形成豚鼠抗体-磁性纳米粒子生物复合物(Fe3O4 NPs/pAb1);兔抗与CdZnTe量子点间通过酰胺键形成兔抗-CdZnTe量子点的生物共轭物(CdZnTe QDs/pAb2)。第三步,基于豚鼠抗体功能化的磁性纳米粒子和兔抗锚定的CdZnTe量子点设计一种用于检测痕量李斯特菌的荧光免疫传感方法。Fe3O4NPs/pAb1作为免疫磁分离器针对性捕获目标菌,CdZnTe QDs/pAb2作为特异性信号指示剂,磁分离器、信号指示剂和目标菌在抗原-抗体间作用力下形成稳定的夹心模式,最后通过荧光信号检测进行李斯特菌的定量分析。本文的研究结果表明:通过分析SDS-PAGE电泳图得到抗体的纯度相较于未纯化前有了显著提高,兔和豚鼠抗体效价分别超过1:256000和1:64 000。所制备的兔抗和豚鼠抗体具有效价高、特异性好和灵敏度高等特点。优化检测条件后,所提出的荧光免疫传感方法对李斯特菌的特异性检测具有1至109 CFU mL-1的宽检测范围和1 CFU mL-1的低检测限(LOD),实现了对李斯特菌异常灵敏的检测。李斯特菌在水和巴氏杀菌牛奶样品中的加标回收率在91-111%(RSD<4.39%)的可接受范围内。同时,该免疫传感方法对目标菌的检测耗时60 min,实现了复杂样品中的快速准确测定。此外,由于具有长波荧光发射的CdZnTe QDs/pAb2的指示和超小的顺磁性Fe3O4 NPs/pAb1的磁分离,所构建的免疫传感策略对生物基质具有优异的抗干扰性能。综上所述,高灵敏性、强特异性和较好抗干扰性的免疫传感方法在痕量李斯特菌测定中显示出巨大的潜力。有意义的是,本工作提出的免疫传感策略具有普适性,通过简单地替换特异性抗体即可用于其他食源性病原体检测。最后对全文总结如下:1.基于免疫磁分离和抗体修饰的长波荧光发射的CdZnTe量子点指示剂构建了免疫分析策略。2.该荧光免疫传感方法具有操作简单、耗时少、灵敏度高、对生物基质抗干扰性能优异等优点。3.本工作提出的免疫分析策略具有普遍适用性,可通过简单地替换特异性抗体,应用于其他食源性病原体检测。4.在实际应用中显示出检测李斯特菌的巨大潜力,对控制食源性疾病的爆发具有重要意义。
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