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胶原蛋白是一类在所有脊椎动物中都存在的纤维状、大分子蛋白质，由结缔组织细胞和其他类型的细胞(如肝脏、肺、脾及脑组织细胞)所分泌，其主要功能是作为细胞骨架的三种纤维(微管、微丝和中间纤维)的连接蛋白。在鱼类肌肉组织中，胶原蛋白作为肌肉连接组织的结构蛋白，在维持鱼类肌肉质构与肌纤维的形成中发挥着重要作用。草鱼(Ctenopharyngodonidellus)摄食天然植物蚕豆肌肉变脆、韧性和硬度显著增加，当地称做“脆肉鲩”。对脆肉鲩的肌肉成分分析表明肌肉中胶原蛋白含量显著增加，为探索蚕豆对草鱼肌肉胶原蛋白的调控机理，本研究从鱼类肌肉胶原蛋白的主要成分Ⅰ型胶原蛋白入手，首次克隆了编码草鱼Ⅰ型胶原蛋白的α1和α2基因(COL1A1，COL1A2)的cDNA全长序列，进行了该两个基因的氨基酸序列和同源性分析；利用ProtParam软件对COL1A1和COL1A2的蛋白质序列理化性质等参数的生物信息学在线分析；利用半定量RT-PCR技术检测该2个基因在草鱼和脆肉鲩的各8个组织的mRNA表达量；基于qRT-PCR技术和Western印迹技术分析了草鱼和脆肉鲩肌肉中COL1A1和COL1A2的mRNA与蛋白水平表达量。
主要研究结果包括：
1.草鱼Ⅰ型胶原蛋白α1、α2基因的cDNA全序列克隆与分析
从草鱼肌肉中提取总RNA，结合RT-PCR和RACE方法获得Ⅰ型胶原蛋白α1和α2基因(COL1A1，COL1A2)全长cDNA序列。COL1A1与COL1A2cDNA全序列分别为5772bp和4899bp，其开放阅读框分别为4347bp和4059bp，各编码1448和1352个氨基酸。应用SignalP软件对COL1A1和COL1A2基因的氨基酸序列进行分析，发现2种基因的氨基酸序列均具有一个24个氨基酸的信号肽，分别在M1-G24和M1-S24区域。BLAST同源性分析结果显示，草鱼COL1A1和COL1A2基因的氨基酸序列与斑马鱼、金鱼同源性较高，分别为93.90％、95.00％和93.60％、94.40％，呈现出较高的保守性。利用Maga4.0软件分析的系统进化树表明，2个基因均与斑马鱼、金鱼处于同一支，亲缘性最近。
2.草鱼COL1A1和COL1A2基因的蛋白质序列生物信息学分析
利用ProtParam软件对草鱼COL1A1和COL1A2蛋白质序列理化性质在线分析显示，草鱼COL1A1和COL1A2蛋白质的相对分子质量分别为137.2KD和127.4KD；理论等电点分别为5.44和9.37。利用PriPred软件对草鱼COL1A1和COL1A2蛋白质氨基酸序列二级结构及可信度在线分析，结果显示，草鱼COL1A1和COL1A2蛋白质氨基酸序列分别有6个和5个α螺旋结构域，有12和8个β折叠域，其余区域为无规则卷曲域，无跨膜区域，二硫键形成位点Cys分别有18和8个。表明2种蛋白均为α螺旋β折叠三重螺旋结构蛋白。利用ProSite软件对草鱼COL1A1和COL1A2蛋白结构功能域在线分析，结果显示，2种蛋白分别有18和16段三重螺旋重复域，22和21段低复杂度域，17和10个功能域。
利用ProtScale软件对草鱼COL1A1和COL1A2蛋白质亲疏水性在线分析，疏水指数均为-0.739，表明2种蛋白质均具有较强的亲水性。在溶液中的不稳定指数分别为25.15和24.28，表明两者在溶液中均较稳定；分析两者结合微量元素功能发现，COL1A1蛋白有33-69，1249-1355两个绑定钙的区域和62-104一个绑定锌的区域，COL1A2蛋白有1155-1268和1176-1193两个绑定锌区域，没有绑定钙区域。
3.蚕豆对草鱼Ⅰ型胶原蛋白基因(COL1A1和COL1A2)组织表达调控研究
利用半定量RT-PCR方法检测草鱼和脆肉鲩各8组织COL1A1和COL1A2基因的mRNA在8种不同组织中的表达量，结果表明：COL1A1和COL1A2基因在草鱼和脆肉鲩的肌肉、肠道、肝胰脏、鳃、皮肤、鳍条、肾脏和脾脏8个组织中均有表达，2种基因在草鱼皮肤、鳃、肾脏、鳍条组织中的mRNA表达量高于其他4个组织(p<0.05)。脆肉鲩各组织RT-PCR检查结果显示，COL1A1基因在皮肤、鳍条的mRNA表达量高于其他6个组织(p<0.05)，在肝胰脏、脾脏组织中最低(p<0.05)；COL1A2基因在鳃、鳍条、皮肤的mRNA表达量最高(p<0.05)，在脾脏、肾脏中最低(p<0.05)。COL1A1和COL1A2基因在草鱼和脆肉鲩各组织的mRNA表达量对比结果显示2种基因除在肠道、脾脏、肾脏组织外均有上调趋势。
4.基于qRT-PCR技术和Western印迹技术分析了草鱼和脆肉鲩肌肉中COL1A1和COL1A2的mRNA与蛋白水平表达量
利用荧光定量PCR技术定量检测草鱼和脆肉鲩肌肉COL1A1和COL1A2基因的mRNA表达量，结果显示脆肉鲩肌肉中该两者的mRNA表达量分别是草鱼的2.7和2.1倍(p<0.05)。运用Western免疫印迹技术检测在草鱼和脆肉鲩肌肉中COL1A1和COL1A2的蛋白水平表达差异，结果表明，2种蛋白在脆肉鲩肌肉中的表达量均增加(p<0.05)。
综上所述，本文首次克隆了草鱼Ⅰ型胶原蛋白α1和α2基因(COL1A1，COL1A2)全长cDNA序列并对其进行了生物信息学分析，首次系统的研究并发现2种基因的mRNA在草鱼和脆肉鲩的肌肉、肠道、肝胰脏、鳃、皮肤、鳍条、肾脏和脾脏8个组织中均有表达与分布，初步探讨了蚕豆对草鱼COL1A1和COL1A2基因组织分布的表达调控。从基因水平和蛋白水平上进一步研究了蚕豆对草鱼肌肉胶原蛋白和Ⅰ型胶原蛋白含量的表达调控。本文的研究结果为探索蚕豆调控草鱼肌肉胶原蛋白表达的分子机理提供了基础数据，为鱼类肌肉Ⅰ型胶原的营养调控研究提供新的研究方向。