鳜、鲢鳃发育及eda、edar基因表达的研究

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鳜鱼(Siniperca chuatsi),又名桂花鱼,隶属鲈形目(Percoidea),因其营养丰富、味道鲜美而具有很好的养殖前景,从开口阶段起就仅食活鱼虾,而鲢鱼(Hypophthalmichthys molitrix)以浮游生物为食,两者鳃的形态结构存在很大差异,其中最直观的就是鳃耙的疏密程度,鳜鱼成鱼的鳃耙稀疏而坚硬,鲢鱼成鱼鳃耙密集,而且连成柔软的膜质片。鳃耙是一种具有滤食作用的结构,鳜鱼、鲢鱼食性不同,且鳃耙形态结构和数目也存在差异,为探究这种差异是否与食性相关,本论文在出膜早期对鳜鱼、鲢鱼鳃形态发育特征进行了研究,而为了进一步了解影响这种鳃发育差异的遗传因素,论文也对关键调控基因的表达特征进行了研究,基因结构分析发现,骨骼发育相关基因eda(ectodysplasin)的外显子和内含子数目在鱼类中较保守,而edar(ectodysplasin receptor)外显子和内含子数目则差异较大,eda与皮肤附属结构发育相关,而edar被证实与鱼类的鳞片等发育相关,推测是edar的结构差异导致了鱼类鳞片发育等相关性状差异。同线性分析发现eda和edar上游有些基因也与皮肤附属物或骨骼发育相关,这种与上游基因的紧密相关性可能预示着它们在功能上的一致性。在上述理论基础上,本研究所得到的主要结果结论如下:1.出膜早期鳜鱼苗(1-7 days post-hatch,dph)、鲢鱼苗(4-10 dph)鳃部茜素红染色和显微解剖发现,两种鱼苗的鳃弓数目与成鱼一致,从出膜早期到成鱼的过程中,鳃弓数目并未增加,仅鳃弓大小随鱼体变大、变粗。鲢鱼苗的鳃耙数目、形态变化大,出膜4-10 d,其鳃耙数目从8增加到13,鳃耙平均间距从495.39 减小到387.38 μm,鳃耙形态由短变长、由疏变密,直至成鱼的鳃耙变得十分密集而连成膜质片。而鳜鱼苗鳃耙数目、形态变化较小,出膜1-6 d以鳃耙数目的增加为主,而第7d开始,以鳃弓发育为主,鳃耙数目已达上限,其鳃耙数目从6增加至8个,鳃耙平均间距在475.35-749.55 μm之间变化,鳃耙在鳃弓上呈点状分布,不容易发现,成鱼的鳃耙数目与出膜早期鳜鱼苗相差无几,均为7-8个,但更为坚硬、稀疏。2.进化分析发现,eda进化树把革首南极鱼、鳜鱼、大黄鱼等鲈形目eda与三刺鱼、半滑舌鳎、青斑河豚eda聚为一支,鳜鱼、罗非鱼、青鳉edar较相似。这种聚类表明鳜鱼与这些鱼可能在鳞片发育、鳃发育上的关联性。3.以鳜鱼转录组、鲢鱼基因组的eda和edar基因序列设计、筛选出了可特异性扩增目的片段的荧光定量引物,检测引物扩增效率达99%,对脑、肝、鳃丝、鳃弓、鳃耙、皮肤6个组织进行荧光定量PCR(RT-PCR),检测结果发现,eda主要在鲢鱼肝、鳃丝、鳃弓、皮肤和鳜鱼鳃弓、鳃耙、皮肤中表达,而edar主要在鲢鱼鳃弓,以及鳜鱼鳃弓、鳃耙、皮肤中表达。eda和edar在鲢鱼鳃部表达差异较大,而在鳜鱼的鳃部表达一致,这可能是造成两种鱼鳃耙发育模式不一样的原因之一。4.以成鱼组织表达结果和茜素红染色结果为参照,以鳃发育变化大的鲢鱼苗为研究对象,研究出膜早期鳃发育与基因表达的关系。筛选出了鲢鱼edar基因的特异性探针引物后,以鳃组织cDNA为模板进行普通PCR,PCR产物纯化后体外转录合成了鲢鱼edar的RNA探针,用于出膜早期(13-22 dph)鲢鱼苗的原位杂交。结果发现,edar在鲢鱼鳃部有表达,且随时间推移,杂交显色的程度越明显。结合RT-PCR结果分析发现,edar主要在鲢鱼成鱼的鳃弓表达,其次为鳃耙,随发育推进鲢鱼苗鳃部edar表达增加,说明在出膜早期其鳃弓和鳃耙处于发育中,这与形态学分析结果一致,这种形态的变化也是与鲢鱼朝着滤食性方向发展相适应的。
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