雪地衣藻Chlamydomonas nivalis是一种能适应极端环境的单细胞绿藻,它能抵御低温、高光照、强紫外辐射等胁迫条件,其胞内脂质的变化与抵抗胁迫环境密切相关。系统研究雪地衣藻胞内脂质随胁迫条件的变化规律,找出雪地衣藻响应胁迫环境的特征性脂类物质,对阐明细胞抗胁迫生理机制具有重要意义。本论文在通气培养状态下,分别以0.25%、0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50% NaCl对雪地衣藻C.nivalis对数期细胞进行胁迫处理,随后系统分析了胁迫0、1、2、3、5、7、11、15、24、48 h后细胞的脂质组成。主要研究结果如下:1、通气培养下细胞生长速率大大提高,其生长周期比不通气缩短约1/3。考察NaCl浓度对细胞的生长抑制率和致死率发现:NaCl对细胞的生长抑制随着浓度升高而加强,1.50% NaCl时达到最高生长抑制率为56%,但此时死亡率仅为6.07%,说明生长抑制并未造成细胞的大量死亡。2、利用激光共聚焦扫描显微镜进行了胁迫处理和对照样品的细胞荧光强度的观察和定量分析。结果显示,经Nile Red染色、543nm激光激发,560~615 nm的脂质荧光强度随着胁迫时间延长先增大后减小,在7 h左右达到最高,并在24 h左右降到对照的水平。脂质荧光强度随NaCl浓度的升高亦呈现先增大后减小的趋势。在NaCl浓度为0.75%时,各胁迫时间点的脂质荧光强度比其它NaCl浓度在相应胁迫时间下的脂质荧光强度都大,胁迫处理7 h时达到最大变化率为211.72%。3、采用流式细胞术对胁迫处理和对照样品进行了细胞体积、中性脂、极性脂荧光强度的定量分析。结果表明,经Nile Red染色、488 nm激光激发,中性脂(FL1,530 nm)和极性脂(FL2,575 nm)的荧光强度分别随着胁迫时间延长和NaCl浓度增加而先增加后减小。1.00% NaCl处理7 h的中性脂变化最大,高达68.16倍;1.25% NaCl处理5 h的极性脂变化最大,为10.27倍。在同一NaCl浓度胁迫下,细胞体积(SSC信号)在3~5 h内迅速增大,此后增大不显著;在相同胁迫时间下,细胞体积随NaCl浓度的变化不显著。4、用GC-MS分析了NaCl胁迫处理前后样品的游离脂肪酸和组成中性脂的脂肪酸组成。结果表明,(1)游离脂肪酸的特征性组分是C16:0、C18:1和C18:3,其含量变化规律如下: C16:0在0.25% NaCl胁迫5 h时达到最高含量为71.41μg/mg,比对照增大了2.16倍;0.25%~1.50% NaCl胁迫处理时,C18:3含量变化巨大(9.68~89.05μg/mg);0.25% NaCl胁迫处理时,C18:3含量在胁迫2 h后开始增大,达到最大值后在11~15 h之间迅速降低;0.75%~1.50% NaCl胁迫时,C18:3含量随胁迫处理时间逐渐降低;0.25%~1.50% NaCl胁迫处理后,C18:1最高含量为34.84μg/mg,比对照增大了2.45倍。结果说明C16:0、C18:1和C18:3在总游离脂肪酸、总不饱和脂肪酸、总脂不饱和度中的比例分别达到75%、70%、65%以上,对于细胞抵抗高盐胁迫环境具有重要作用,也是细胞响应NaCl胁迫重点调控的脂质。(2)中性脂(NL)样品中的特征性脂肪酸是C16:0和C18:3,其含量变化规律如下: 0.25%~1.50% NaCl胁迫处理后C16:0的最高含量为5.75μg/mg,比对照提高了5.69倍;C18:3在0.25%~1.50% NaCl胁迫后可升高到最大值13.98μg/mg,比对照提高了5.66倍,最低时未被检出。中性脂另一特征性组分—叶绿醇(phytol),在NaCl胁迫处理2 h内,含量迅速升高到最大值25.31μg/mg,比对照提高了1.59倍。随后下降,在48 h内降到12μg/mg左右但仍高于对照。结果说明C16:0和C18:3在NL样品中总脂肪酸、总不饱和脂肪酸、总脂不饱和度中的比例分别达到75%、78%、85%以上。C18:3不仅决定着NL中总不饱和脂肪酸的调控方向,也决定着NL中的总脂不饱和度。C16:0和C18:3与细胞对抗高盐环境的能力密切相关。5、上述研究结果揭示了雪地衣藻抵抗NaCl胁迫的主要生理机制,即:细胞通过调节特征性脂肪酸的瞬时合成,快速调整饱和与不饱和脂肪酸的比例,从而改变细胞膜的流动性、胞内渗透压来达到快速响应高盐胁迫、抵抗高盐环境的目的。而叶绿素含量的快速增加有利于为高盐胁迫下的生理相应提供更多的能量。