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在猪卵母细胞和胚胎中存在大量脂滴,近年来,学者们主要集中在脂滴对于胚胎冷冻效率的研究,通过离心去脂或者化学去脂等方法将脂滴去除会显著提高猪胚胎的冷冻效率。但是猪卵中脂滴成分变化,脂滴如何生成,很少见报道。本实验通过离心去脂建立一种脂滴缺乏模型,研究在脂滴缺乏情况下脂滴中主要成分三酰甘油是如何变化的,同时集中观察调节甘油三酯生成的关键酶LIPIN1。LIPIN1不仅在三酰甘油生成通路中扮演磷脂酸磷酸酶的功能,同时也与其它核因子PPARα,PPARy发生互作,调节脂肪酸代谢与生成。在猪胚胎中LIPIN1是否会和这两个因子发生互作并未见报道。本文通过离心去脂以及对LIPIN1基因进行RNA干扰,来探索它们之间的关系。1、离心去脂对胚胎发育能力的影响为了得到脂滴缺乏胚胎模型,我们采用离心去脂的方法,在卵母细胞MII期软化透明带,将胚胎放在含有CB的T2培养液中进行高速离心,离心后通过去透明带将卵母细胞和离出胞质的脂滴完全分离。对照组卵母细胞完全去透明带。后对两种MII期无透明带卵母细胞进行孤雌激活,统计2-细胞,4-细胞卵裂率以及囊胚率,囊胚细胞数,发现对照组和去脂组之间都没有差异。2、离心去脂效率检测为了检测离心去脂效率,收集MII期,1-细胞期,2-细胞期,4-细胞期以及囊胚期的胚胎,采用Bodipy染色,通过激光共聚焦显微镜拍照。发现在离心去脂后MII期大量脂滴被离出胞质,仅有少量小脂滴留在胞质中。随着早期胚胎发育脂滴逐渐向皮质层扩散,并在皮质层形成较大的脂滴,在囊胚期每个卵裂球中都有极少量的脂滴存在。在对照组中,脂滴主要分布在胞质中,在核上没有脂滴。3、在胚胎缺乏脂滴的情况下,三酰甘油含量检测在对照组中,从GV期到MII期卵母细胞中三酰甘油含量显著性下降,说明卵母细胞成熟过程中消耗了大量三酰甘油。随着早期胚胎发育,三酰甘油含量逐渐增多,但并无显著差异。离心去脂极显著降低了胚胎中三酰甘油含量,在胚胎发育过程中三酰甘油含量也是一个缓慢的增长趋势,但差异不显著。4、离心去脂后三酰甘油生成相关基因表达变化在离心去脂后,三酰甘油生成相关基因表达都受到了影响,在MII期表达都极显著低于对照组,但是在1-细胞期DGAT表达显著高于对照组,GPAT1和LIPINI在4-细胞时期表达显著高于对照组。而与LIPIN1相关的PPARα在4-细胞时期表达也显著高于对照组。5、离心去脂胚胎中LIPIN1的分布以及表达量变化MII期的卵母细胞中的少量LIPIN1随着离心去脂被离出胞质,剩余的LIPIN1均匀分布在胞质中,但是在1-细胞,2-细胞,4-细胞时期,LIPIN1主要分布在皮质层,而对照组中LIPIN1仍旧均匀分布在胞质中。随着去脂胚胎发育在核周围发现有新生LIPIN1生成,围绕着细胞核。在囊胚期,大量的LIPIN1在每个卵裂球中均匀分布。虽然离心去脂后LIPIN1表达量显著低于对照组,但是随着离心去脂胚胎的发育LIPIN1表达在逐渐增加。6、LIPIN1 和 PPARα,PPARγ 之间的互作建立一种电穿孔RNA干扰新方法,证明了这种方法的有效性,对LIPIN1进行RNA干扰后发现,PPARα表达显著性降低,PPARy表达没有发生显著性变化。说明LIPIN1与PPARα的互作存在于猪孤雌激活胚胎中。