阪琦肠杆菌(Enterobacter sakazakii)作为常见的食源性致病菌,普遍存在于环境和婴幼儿乳制品中,容易寄生在人和动物肠道内从而导致婴幼儿和免疫力低下的人群及动物致病,有很高致死率。近年来阪琦肠杆菌的防控研究已成为热点,但缺少特异性的检测方法,制约了该病的有效防控。因此建立特异性强、灵敏度高的阪琦肠杆菌快速检测方法是预防和控制该病的关键。本研究利用4种来源不同的阪琦肠杆菌标准株混合后作为抗原,分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔,制备针对阪琦肠杆菌的单克隆和多克隆抗体,建立间接免疫荧光和以抗体结合酶联免疫原理的双抗夹心ELISA检测方法。1.阪琦肠杆菌单克隆抗体采集经4次阪琦肠杆菌免疫后血清效价在16 000以上小鼠脾细胞,与骨髓瘤细胞融合后,对筛选出的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆,共筛选出4株能稳定分泌抗阪琦肠杆菌的单克隆杂交瘤细胞,将其分别命名为3A6、5B9、2B6、EF12。将筛选出的细胞株注射到小鼠腹腔制备单抗腹水,间接ELISA检测方法测得4株单抗的血清效价均在10~5以上,交叉反应显示4株单抗具有良好的特异性,能识别阪琦肠杆菌不同的6个菌种,且与常见的肠出血性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌等均无交叉反应。单抗亚型鉴定结果表明,4种抗体的轻链皆为Kappa型,重链除了EF12为Ig G2a其余3株为Ig G1。经过碘酸钠法将4株阪琦肠杆菌制备成辣根过氧化物酶(HRP)酶标抗体,并通过直接竞争ELISA检测方法证明该4株抗体抗原决定簇的交叉反应性,结果表明4株阪琦肠杆菌单抗之间无交叉反应。用同样4株阪琦肠杆菌作为混合抗原免疫新西兰兔,成功获得抗体效价在10~5以上的多克隆抗体,为双抗夹心ELISA检测方法的建立奠定基础。2.阪琦肠杆菌间接免疫荧光检测方法的建立。采用火焰固定法将待检测菌固定于载玻片上,建立阪琦肠杆菌间接免疫荧光检测方法,通过对试验方法的优化,确定最佳封闭液为1%BSA,封闭时间为30 min,以制备的阪琦肠杆菌细胞株5B9为一抗,最佳稀释倍数为1:4 000倍,FITC标记二抗最佳稀释倍数为1:20 000倍。通过对模拟样品的检测,该方法的灵敏性可以达到2.5×10~7CFU/m L,且与常见的肠出血性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌等均无交叉反应。表明建立的间接免疫荧光检测方法具有良好的特异性,该方法的建立为阪琦肠杆菌的免疫学检测提供技术支撑。3.阪琦肠杆菌双抗夹心ELISA检测方法的建立。以兔源阪琦肠杆菌多克隆抗体作为捕获抗体,以鼠源阪琦肠杆菌单克隆抗体细胞株5B9作为检测抗体,建立阪琦肠杆菌双抗体夹心ELISA检测方法。通过对建立的方法的优化,确定捕抗体包被最佳稀释倍数为1:4 000,最佳封闭液为1%明胶,最佳封闭时间为1.5 h,鼠源阪琦肠杆菌单克隆抗体作为检测抗体,最佳稀释倍数为1:1 000倍,最佳检测抗体孵育时间为1.5 h。HRP标记的羊抗鼠Ig G作为酶标二抗,最佳稀释倍数为1:20 000倍,酶标抗体孵育时间为1h。建立方法的最低检测限为1×10~6CFU/m L,与金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌等均无交叉反应,表明该方法具有较好的特异性。板内和板间差异性均小于10%,表明该方法具有较好的稳定性和重复性。本研究成功制备阪琦肠杆菌多克隆抗体和单克隆抗体,并建立阪琦肠杆菌的间接免疫荧光法及双抗夹心ELISA检测方法,建立的方法特异性强,灵敏度高,操作简便,为阪琦肠杆菌的快速检测提供技术支持。