肝纤维化是肝脏对不同病因引起的慢性肝损伤的弥漫性、可逆性修复反应，肝纤维化评估对于慢性肝病的诊断和疗效评价尤为重要。　　肝脏星形细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化是肝脏纤维化进程中的中心事件。HSCs在生理状态下处于静止状态，在肝损伤后可迅速活化并发生细胞表型的改变，转化为成肌纤维细胞并大量增殖。活化的HSCs(activated HSCs，aHSCs)是损伤肝组织中过度沉积的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的主要来源;同时其可分泌多种促炎性及促纤维生成活性细胞因子，带动肝内其他细胞共同参与肝脏纤维化进程。而aHSCs的减少或活性的降低与肝纤维的恢复与逆转密切相关。因此，监测HSCs的活性有可能成为评估肝纤维化的新途径。生理状态下，整合素αvβ3仅在肝脏门静脉周围少量表达，而在肝纤维化进程中，随着HSCs的活化，其表达可明显上调，并与aHSCs的增殖与存活密切相关。因此，其可作为aHSCs的生物学标记物用于评价aHSCs的活性，进而评估肝纤维化。　　整合素αvβ3能够识别多种ECM成分中特异构象的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（argine-glycine-aspartate，RGD）序列，与其特异性结合。利用这一特性，人工合成含有RGD三个氨基酸序列的多肽及多肽类似物，用放射性核素进行标记，可用于整合素αvβ3异常表达疾病的分子靶向显像。但目前，通过此类示踪剂评估肝纤维化的研究报道却非常少。　　99mTc-3PRGD2是整合素αvβ3特异性放射性示踪剂，其结构中含有2个RGD环五肽，通过单光子发射显像技术可显示组织或器官内的放射性浓聚程度，反映整合素αvβ3的表达水平及功能状态，目前已经应用于对多种肿瘤性疾病的诊断，但尚未应用于肝纤维化领域。本研究首次将其应用于肝纤维化领域，通过大鼠肝纤维化模型旨在探讨(1)99mTc-3PRGD2分子显像评估肝纤维化的可用性;(2)其在肝纤维化严重程度分级及疗效评估中的应用价值。　　材料和方法:　　一、构建动物模型及分组　　8周龄雄性Wistar大鼠，体重188-262g(226±19g)。硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)溶解于无菌注射用水，质量浓度4％，棕色瓶常温密封保存，每周配置一次。模型组大鼠每周三次（周1、3、5）按300mg/kg经腹腔注射，根据个体体重变化调整给药剂量，降低死亡率。对照组大鼠不予处置。　　论文由两部分组成:　　第一部分:模型组于TAA给药5周后显像(n=6);验证该分子显像手段在评估肝纤维化的可用性，初步确定显像流程及评价肝脏摄取99mTc-3PRGD2水平的显像参数的方法。　　第二部分:模型组于TAA给药2、4、6、8周及给药6周后撤药2周进行显像，各时间点6只;将前3个时间点模型大鼠按肝纤维化严重程度分组，探讨该显像手段在肝纤维化分级诊断中的应用价值。TAA给药8周大鼠设定为A组，TAA给药6周后撤药2周构建祛除肝纤维化诱因的治疗有效模型，即B组，比较两组显像上的差别，评价该显像手段在肝纤维化疗效评估中的应用价值。　　二、显像及图像分析　　显像前大鼠均经腹腔注射10％水合氯醛（0.3-0.4ml/100g体重），麻醉满意后仰卧位固定，用5号半头皮针经尾静脉建立静脉通道，生理盐水封管。提前20min将3PRGD2药盒从4℃冰箱内取出，取1ml新鲜99mTc-高锝酸钠洗脱液740～1110MBq(20～30mCi)加入到3PRGD2药盒中，充分振荡使药盒中固体样品彻底溶解至澄清，100℃加热20min。反应完成后，冷却至室温备用。用SPECT(single photonemission computed tomography，Infinia Hawkeye，GE Healthcare)扫描仪成像，选用低能高分辨准直器，能窗20％，以140keV为中心。经尾静脉“弹丸”式注射99mTc-3PRGD2后，即刻进行平面动态图像采集，采集前位相，探头距大鼠腹平面约10cm(矩阵128×128，放大倍数1.33，1帧/min，共90min)。　　应用Xeleris3.0工作站进行图像处理。在大鼠肝脏及心脏区域勾画大小为20像素的圆形感兴趣区(region of interest，ROI)，获得肝脏与心脏ROI的时间放射性曲线(time-activity curve，TAC)，通过肝脏和心脏TAC可分别得到99mTc-3PRGD2在肝脏与心脏的半排时间（half life time of liver and heart，liver t1/2和heart t1/2）;同时，计算99mTc-3PRGD2注射后各时间点肝脏与心脏ROI的放射性计数比值(ratioof liver ROI to heart ROI radioactivity，L/H)，生成时间-L/H曲线。　　三、体外实验　　显像后取肝中叶矢状切面，大小约10mm×3mm×3mm（长度×宽度×厚度）置于10％中性甲醛，行后续病理HE染色、天狼猩红染色，荧光及免疫组化染色;另取少量（约50mg）肝脏分装冻存（-80℃）进行后续的实时定量多聚酶链反应(real time-polymerase chain reaction，RT-PCR)和Western blot用于检测整合素αv、β3亚基及α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达。　　通过天狼猩红染色应用Ishak评分标准进行肝纤维化程度分级，并应用Image-Pro Plus软件测定肝脏胶原比例面积(collagen proportionate area，CPA)，该指标可对肝纤维化进行定量分析。　　四、统计分析　　数据用中位数（最大值-最小值）表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验(SPSS13.0);多组间比较采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）及Newman-Keus检验(Graphpad Prism5.0);应用Spearman相关分析评价指标间的相关性(Graphpad Prism5.0)。应用受试者工作特征(receiver-operating characteristic，ROC)曲线评估显像定量指标对不同程度肝纤维化的预测效能(MedCalc)。　　结果:　　正常对照组大鼠无死亡;镜下肝小叶结构完整，肝细胞无变性坏死，肝内未见确切纤维索条形成(Ishak0)。模型组大鼠镜下肝细胞可见不同程度变性、坏死，肝纤维化Ishak分级评分0-6。　　第一部分:建模过程无动物死亡。模型组大鼠肝脏纤维化Ishak评分1-5;与对照组比较，CPA明显升高，两组比较差异有统计学意义(Z=-2.887，p=0.002)。整合素αvβ3在正常对照组大鼠肝脏内无阳性表达，而α-SMA仅在肝脏大血管壁见阳性表达;模型组大鼠肝脏整合素αvβ3及α-SMA的表达均明显升高，整合素αvβ3的表达区域与α-SMA大部重合。　　显像发现，99mTc-3PRGD2注射后随时间延长，肝脏及心脏内放射性分布逐渐降低。正常对照组及模型组大鼠的肝脏TAC在显像前30min内均迅速降低，随后肝脏TAC下降速度趋于平缓，而模型组大鼠曲线下降幅度及速度均小于正常对照组;两组心脏TAC下降趋势相近。因此初步确定liver t12及99mTc-3PRGD2注射后30min肝脏与心脏ROI的放射性计数比值(ratio of liver ROI to heart ROIradioactivity at30min post-injection of99mTc-3PRGD2，L/H30min)作为评价肝脏摄取99mTc-3PRGD2的指标。比较两组liver t1/2及L/H30min，模型组均大于正常对照组，组间差异均有统计学意义（Z值分别为-2.082、-2.887， p分别为0.041和0.005）。肝纤维化Ishak评分与liver t1/2及L/H30min均呈显著正相关（r分别为0.648、0.762，p分别为0.023、0.004）;CPA与liver t12及L/H30min均呈显著正相关（r分别为0.767、0.805，p分别为0.004、0.002）。　　第二部分:共30只模型组大鼠完成实验，建模过程中死亡6只，分别发生于建模第3周（1只），4周（1只），6周（2只），7周（1只），8周（1只），成模率(83.33％，30/36);将TAA给药2、4、6周，各时间点6只共18只大鼠，按肝纤维化严重程度分为轻度纤维化组（Ishak1-2），中度纤维化组(Ishak3-4)及重度纤维化组(Ishak5-6)，每组6只;随着肝纤维化程度的加重，CPA逐渐升高;但轻度纤维化组与正常对照组间CPA差异无统计学意义(q=1.264，p＞0.05)，余各组间CPA差异均有统计学意义(p＜0.05)。L/H30mm随肝纤维化的进展逐渐升高，每两组间比较差异均有统计学意义(p＜0.05);而liver t1/2仅在正常对照组(Ishak0)与重度纤维化组(Ishak5-6)，轻度纤维化组(Ishak1-2)与重度纤维化组(Ishak5-6)组间差异有统计学意义(p＜0.05)，余每两组间差异均无统计学意义(p＞0.05)。L/H30min与Ishak评分及CPA均呈显著正相关（r分别为0.91、0.93，两者p＜0.0001）。整合素αvβ3及α-SMA在正常对照组及轻、中度肝纤维化组的表达逐渐升高，而在重度肝纤维化组表达均较中度肝纤维化组降低。　　A组6只大鼠病理诊断均为肝硬化（Ishak6），B组中3只诊断为肝硬化(Ishak6)，另3只为中度纤维化(Ishak3)。B组CPA小于A组，两组间差异有统计学意义(Z=-2.882，p=0.002)。B组L/H30min小于A组，两组间差异有统计学意义(Z=-2.892，p=0.002)。将B组3只肝硬化大鼠与A组中6只肝硬化大鼠比较，前者CPA和L/H30min均明显低于后者，差异有统计学意义(Z=-2.324，-2.334，p均为0.024)。　　结论:　　1、99mTc-3PRGD2靶向整合素αvβ3分子显像可用于肝纤维的诊断;L/H30min及liver t1/2可作为评价肝脏摄取99mTc-3PRGD2水平的指标。　　2、99mTc-3PRGD2靶向整合素αvβ3分子显像可用于肝纤维化的分级;L/H30min相对liver t1/2在此方面更具优势，其可有效地将早期肝纤维化与其他级别纤维化区分开，证实该显像方法在肝纤维化早期诊断中具有优势。　　3、99mTc-3PRGD2靶向整合素αvβ3分子显像可用于肝纤维化治疗后疗效的评估，其可敏感地反映肝纤维化的逆转。