研究目的流感是由流感病毒引起的上呼吸道疾病,具有传染性强、传播快、潜伏期短、发病率高的特点,每年影响数百万人的健康,并造成比较严重的经济和社会问题。近年来,甲型H5N1高致病性禽流感和H1N1流感在世界范围内的蔓延更加引起了公众对流感的关注,抗流感病毒的药物研究也因此成为研究的热点领域。作为基于结构的合理药物设计的成功例子之一的流感病毒神经氨酸酶抑制剂(NAIs)是抗流感病毒药物研究中取得的重大突破性进展。NAIs对A、B型流感病毒都有效；通过抑制流感病毒神经氨酸酶(NA)的活性,阻止子代病毒从宿主细胞表面释放而起到控制流感的作用；并且与其它抗流感病毒药物相比,不易产生抗药性且耐受性较好。目前上市的NAIs有两种：葛兰素公司的zanamivir (GG167,商品名Relenza)和罗氏公司的oseltamivir (GS4104,商品名Tamiflu)另外,由强生和BioCryst公司合作开发的peramivir(RWJ2270201),在2009年H1N1大流感中作为紧急授权药物应用于临床。流感病毒神经氨酸酶(NA)是存在于A、B型流感病毒表面的糖蛋白,在流感病毒复制和感染过程中起着重要的作用。流感病毒神经氨酸酶能催化裂解存在于细胞表面糖蛋白末端的SA与邻近寡糖之间的α(2-6)或α(2-3)糖苷键,切断病毒的HA与宿主细胞之间连接的SA残基,促进子代病毒从感染的细胞中释出,并阻止子代病毒从宿主细胞释放后的聚集；还可通过裂解呼吸道黏膜中的唾液酸,阻止病毒灭活,从而促进病毒在呼吸道的传播。另外,在所有亚型的甲型和乙型流感病毒表面分布的神经氨酸酶的催化中心的附近的一段11个氨基酸残基组成的序列高度保守,正是这一特点,使得流感病毒神经氨酸酶成为抗流感病毒药物的一个很有意义的靶点。已报道的流感病毒神经氨酸酶抑制剂根据其母核的结构可以分为唾液酸类、苯甲酸类、环己烯类、呋喃类、环戊烷类、吡咯烷类、多聚体类等。本研究的主要目的是以流感病毒神经氨酸酶为靶点,借助于计算机辅助药物设计和基于结构的药物设计,设计、合成具有新型母核的流感病毒神经氨酸酶抑制剂并对其进行活性研究,以发现具有较好神经氨酸酶抑制活性的、结构新颖的先导化合物。研究方法在前期的神经氨酸酶抑制活性筛选中,本课题组发现2-氨基噻唑-4-乙酸乙酯和2-苯基-4-噻唑烷酸具有一定的NA抑制活性；另外,鉴于当前并没有噻唑和噻唑烷类衍生物作为神经氨酸酶抑制剂的研究或文献报道,该研究以这两个化合物作为NA抑制剂设计、合成的先导化合物,结合计算机辅助药物设计对其进行结构优化,以期望得到NA抑制活性较好的、具有新型母核结构的噻唑或噻唑烷类NAIs作为进一步研究的先导化合物。以2-氨基噻唑-4-乙酸乙酯为先导化合物,根据已知的NA抑制剂与NA活性位点的结合模型,设计一系列噻唑类衍生物作为NA抑制剂：①C-2位的氨基与含有不同疏水侧链的Boc保护的氨基酸的羧基通过酰胺基结合,Boc保留或者脱除而暴露氨基。②C-4位的羧酸乙酯基团保留或者水解成为羧酸。以2-苯基-4-噻唑烷酸为先导化合物,设计一系列噻唑烷类衍生物作为NA抑制剂：①使用含有不同取代基的苯甲醛与半胱氨酸缩合,得到C-2位不同的噻唑烷类化合物。②C-3位的仲胺基团保留或者与氯乙酰氯或苯甲酰氯结合,希望分别加强与NA活性位点的正电极性区域或疏水口袋的相互作用；③氯乙酰化的产物通过氨化得到伯胺衍生物。同时,本研究使用SYBYL软件将设计的噻唑类和噻唑烷类目标化合物与NA晶体结构(PDB ID:2HU4)的活性中心区域进行模拟对接,得到化合物的预测打分值及化合物与NA活性位点的结合模型,观察到化合物与酶的活性中心可以较好的结合。两个系列的目标化合物分别以2-氨基-4-乙酸乙酯和L-半胱氨酸为原料合成,原料经济易得,反应路线科学合理,目标化合物的结构均经过核磁共振氢谱、高分辨质谱确证。研究结果本研究使用流感病毒神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒,筛选了所设计、合成的小分子噻唑和噻唑烷类神经氨酸酶抑制剂,发现所合成的化合物均具有一定程度的神经氨酸酶抑制活性。初步的酶活测试结果显示,合成的噻唑类和噻唑烷类化合物的NA抑制活性尽管都不及阳性对照oseltamivir carboxylate,但与先导化合物相比,大部分都有明显的提高；其中,噻唑类化合物L4d、L5d、L8d和噻唑烷类化合物Y4b、Y4c、Y4f活性较好。另外,本研究利用SYBYL软件对合成的化合物进行了构效关系研究,探讨了两个系列化合物与神经氨酸酶活性区域的作用模式；并且采用比较分子力场分析(CoMFA)方法构建了噻唑烷类化合物的定量构效关系(QSAR)模型,所构建的CoMFA模型具有较好的交叉验证系数和一定的预测能力。研究结论及意义综上所述,本研究选择流感病毒神经氨酸酶作为抗流感病毒药物的靶点,根据流感病毒神经氨酸酶的三维结构及与其活性位点作用的抑制剂的药效团模型,结合体外对神经氨酸酶抑制活性的初步筛选,确定2-氨基噻唑-4-乙酸乙酯和2-苯基-4-噻唑烷酸作为先导化合物,并利用计算机辅助药物设计进行合理药物设计,对先导化合物进行结构修饰,共设计、合成了噻唑类和噻唑烷类两类新型的小分子流感病毒神经氨酸酶抑制剂。活性结果显示,所设计、合成的两类化合物均具有一定的神经氨酸酶抑制活性,并且绝大多数的化合物对NA的抑制活性都比先导化合物有所增强；其中活性最好的化合物为噻唑烷类衍生物Y4f,其活性比阳性对照(oseltamivir carboxylate)弱7倍。这些结果说明,噻唑和噻唑烷类都可以作为新型神经氨酸酶抑制剂的全新母核,并且在以后的研究中,可以使用发现的活性较好的化合物作为抗流感病毒先导化合物,进行进一步的结构修饰和优化,以发现活性更好的、可作为抗流感药物开发的神经氨酸酶抑制剂。