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研究背景随着天宫系列空间实验室的陆续发射,我国载人航天事业逐渐向中长期航天飞行迈进。中长期航天飞行时,失重以及辐射等特殊环境因素对航天员所带来的影响更加突出和复杂,这给我国航天医学研究带来新的挑战。航天失重对骨形成与骨吸收有着重要影响,随着飞行时间的延长,人体出现骨密度减少、骨机械强度降低以及骨组织结构改变,严重影响航天员的身体健康。航天失重对承重骨影响最为显著,承重骨的骨钙每月以1%~2%的速率丢失且没有自限性。成骨细胞是参与骨组织形成的最重要细胞,其功能变化影响骨代谢的动态平衡。近年来,FoxO转录因子家族的功能及其分子调控的机制已逐渐成为免疫、肿瘤以及遗传学的研究热点。有研究表明,FoxO家族在骨重建中起到重要的调控作用,其不仅参与成骨细胞功能的调控,也参与破骨细胞功能的调控。FoxO家族能在不同环境下激活细胞内与周期、凋亡和氧化应激等细胞功能相关的基因的表达,从而影响骨代谢平衡。作为FoxO家族中重要的一员,有研究表明FoxO3a与成骨细胞的功能变化有着密切的联系,但目前对于FoxO3a的研究主要集中在肿瘤领域,FoxO3a在失重性骨质丢失中的作用鲜有研究报道,值得深入开展研究。目的本课题旨明确回转模拟失重对成骨细胞凋亡的影响;观察成骨细胞中FoxO3a转录因子在模拟失重环境下的变化情况,明确其对成骨细胞凋亡的影响及其调控机制,并初步探讨FoxO3a的上游调控机制。方法1.流式细胞技术检测凋亡变化;q RT-PCR技术检测凋亡相关分子Bax、Bcl-2和Caspase-3的m RNA表达变化;Western Blot技术检测Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3的蛋白表达变化情况;使用q RT-PCR检测FoxO3a的m RNA的时程变化;Western Blot检测模拟失重环境下成骨细胞中FoxO3a总量、p-FoxO3a以及细胞核内FoxO3a蛋白表达的时程变化情况;采用免疫荧光技术,检测模拟失重环境下FoxO3a在成骨细胞的细胞核与细胞质内分布的变化。2.使用FoxO3a的si RNA在正常重力环境下将成骨细胞中的FoxO3a敲低,或使用FoxO3a的过表达质粒在模拟失重环境下将成骨细胞中的FoxO3a过表达,采用流式细胞技术分别检测成骨细胞凋亡的变化,Western Blot检测Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3的蛋白表达变化。3.采用流式细胞技术,检测模拟失重环境下成骨细胞中ROS的时程变化情况。采用流式细胞技术,分别检测正常重力环境下敲低FoxO3a或模拟失重环境下过表达FoxO3a后对成骨细胞ROS的影响,Western Blot检测Mn SOD蛋白变化。使用ROS的激动剂H2O2在正常重力环境下将成骨细胞中的ROS过表达,或用ROS的抑制剂NAC在模拟失重环境下抑制成骨细胞中ROS的表达,Western Blot检测Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3的蛋白表达变化。4.采用荧光素酶报告基因实验,验证miR-132-3p与FoxO3a的靶向结合关系,并用q RT-PCR和Western Blot检测过表达以及敲低miR-132-3p对FoxO3a的影响;采用q RT-PCR检测模拟失重环境下miR-132-3p的时程变化情况;在正常重力环境下或模拟失重环境下分别转染mimic-132以及inhibitor-132后,用流式细胞技术检测成骨细胞ROS和凋亡的变化,Western Blot检测成骨细胞中Mn SOD、Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3的蛋白表达变化。结果1.模拟失重环境下,成骨细胞凋亡率显著增高,凋亡相关分子Bax和Cleaved Caspase-3的m RNA和蛋白表达显著增加,能够抑制凋亡的Bcl-2的m RNA和蛋白表达显著下降。模拟失重环境72 h,随模拟失重时间的延长,成骨细胞中FoxO3a的m RNA表达显著减少,FoxO3a蛋白总量显著下降,p-FoxO3a的表达显著增高,细胞核中FoxO3a显著减少。免疫荧光检测发现,随模拟失重时间延长,FoxO3a蛋白在胞浆以及胞核中的表达逐渐降低。2.正常重力环境下敲低成骨细胞的FoxO3a,成骨细胞凋亡率显著增加,Bax和Cleaved Caspase-3的表达显著增加,Bcl-2的表达显著下降;模拟失重环境下过表达成骨细胞的FoxO3a,可部分逆转模拟失重导致的细胞凋亡率增加,部分抑制模拟失重导致的Bax、Cleaved Caspase-3表达增加和Bcl-2表达下降。3.模拟失重环境下成骨细胞中ROS表达随失重时间延长而显著增加;正常重力环境下敲低成骨细胞的FoxO3a,ROS表达显著增高,Mn SOD的蛋白表达显著减少;模拟失重环境下过表达成骨细胞的FoxO3a,可部分逆转模拟失重导致的ROS表达升高和Mn SOD表达降低;正常重力环境下过表达成骨细胞的ROS,细胞凋亡率显著增加,Bax和Cleaved Caspase-3的表达显著增加,Bcl-2的表达显著下降;模拟失重环境下抑制成骨细胞ROS的表达,可部分逆转模拟失重导致的细胞凋亡率增加,部分抑制模拟失重导致的Bax、Cleaved Caspase-3表达增加和Bcl-2表达下降。4.miR-132-3p可与FoxO3a的3’UTR区直接结合;miR-132-3p不影响FoxO3a的m RNA表达但可显著抑制其蛋白表达;回转模拟失重环境下成骨细胞内miR-132-3p在回转48 h表达最高;正常重力环境下,补充miR-132-3p可致成骨细胞中ROS表达显著增高,细胞凋亡率显著增加,Bax和Cleaved Caspase-3的蛋白表达显著增加,Bcl-2和Mn SOD的蛋白表达显著减少;模拟失重环境下,干预miR-132-3p可部分逆转成骨细胞中ROS表达的增高以及细胞凋亡率的增高,部分逆转模拟失重导致的Bax、Cleaved Caspase-3表达增多和Bcl-2、Mn SOD的表达减少。结论1.模拟失重环境可促进成骨细胞凋亡,抑制细胞中FoxO3a的表达。2.FoxO3a表达下降可导致成骨细胞凋亡。过表达FoxO3a可以部分逆转模拟失重导致的成骨细胞凋亡增加。3.FoxO3a通过抑制ROS表达进而对成骨细胞凋亡进行调控。4.FoxO3a是miR-132-3p的靶基因。模拟失重可通过miR-132-3p/FoxO3a/ROS通路促进成骨细胞凋亡。综上所述,我们首次证实模拟失重可通过miR-132-3p/FoxO3a/ROS通路导致成骨细胞凋亡增加。本研究不仅进一步阐明了失重环境调控成骨细胞凋亡的机制,同时也为针对性地研发失重性骨质丢失的防护手段提供了新的方向。