细胞周期调节蛋白激酶2(CDK2)属于高度保守的ser/thr蛋白激酶家族,该类激酶在细胞的增殖过程中发挥重要作用,例如,中心体复制、DNA合成、G1期到S期的过渡和G2期的调控。在哺乳动物细胞中,CDK2主要分布在细胞质、中心小体、细胞核、高尔基体、细胞质膜以及核内体,它与细胞周期蛋白E/A形成异二聚体,调节细胞分裂。人源的CDK2结构为经典的激酶双叶折叠型,包括一段N端(Metl-Val79),二级结构为β折叠的结构域,另一段为C端(Asp86-Leu297),二级结构为α螺旋的结构域。除此之外,还包括一段铰链区(Phe80-Gln85),连接着N端和C端。活性区域(Asp145-Glu172)位于D142FG和A173PE之间,存在底物结合位点。与其它CDK酶一致,解聚的CDK2是没有活性的。CDK2和细胞周期蛋白E,不仅调控细胞分裂G1→S,而且调节中心体的复制。在细胞分裂S期的开始阶段,激活的CDK2和细胞周期蛋白A复合物,促进多种内生底物的磷酸化,从而促进DNA的复制,同时,抑制G1期转录因子E2F的活性。大量实验表明,CDK2的不正常表达,可以造成细胞周期错误调控,这种现象在很多恶性肿瘤中都有发现,例如,肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌和组织肉瘤。因此,CDK2被认作一个治疗肿瘤的潜在药用靶点进行研究。科研人员合成了大量的CDK2抑制剂,并且研究了该类化合物治疗肿瘤的可行性。目前,科研人员主要采用的三种策略设计CDK2抑制剂,其中,应用做多的是设计针对CDK2的ATP结合口袋的小分子化合物。CDK2的ATP结合口袋位于N末端和C末端之间的裂缝中,由21个氨基酸组成。经过研究发现,氨基酸Ile10, Val18、Ala31、Lys33、Phe80、 Glu81、Phe8、Leu83、His84、Gln85、Asp86、 Lys89、Gln131、Leu134、Ala144和Asp145,在结合ATP的过程中发挥着至关重要的作用。由于此ATP结合口袋在CDK蛋白家族中的高度保守,使得针对ATP结合口袋开发选择性CDK2抑制剂变得困难重重。因此,科研工作者将目光转向了发展非ATP结合的CDK2抑制剂。最近,研究人员发现了一个新的结合口袋,由氨基酸Leu55、Lys56、Phe80、Asp145、Phe146和Lys33组成,位于ATP结合位点和C端α螺旋的中间。另外,新的结合口袋也被发现,由Leul24、Phe152、 Val154-Val156、Glul72、Gly176-Thr182、Val184、Val227-Val230, Ser232-Pro234和Asp270-Asn272组成,被5肽LAALS和TAALS占据。然而,到目前为止,针对该非催化性的结合位点的抑制剂还未有报道,由于非催化性和催化性位点之间的区别,也为设计合成选择性的CDK2抑制剂提供了机会。除此之外,研究人员还致力于研究内源性的多肽,例如肿瘤坏死因子的产物pl6INK4、p21WAF1、 p27KIP1和P107。这类抑制剂通过阻断细胞周期,从而有效的抑制细胞增殖。例如,P27KIP1不仅能够与蛋白较浅的凹陷部分结合,而且也能与较深的裂隙部分结合,使得CDK2构象发生较大改变,最终活性消失。因此,多肽也是一种值得深入研究的针对CDK2的抑制剂。目前,报道最多的针对CDK2仍然为ATP竞争性抑制剂,设计合成了七类不同化学结构的针对CDK2 ATP结合位点的化合物,他们具有相似的性质,例如亲水性、较低的分子量和平面性的结构。其中部分化合物,R-roscovitine、SNS-032. MK7965、BAY 1000394、PHA-793887、AT 7519、ZK 304709和R-547进入了临床研究,但是由于副作用和较低的靶点特异性,在二期临床试验时终止。因此,发展选择性的CDK2抑制剂,就变得非常有意义。另一方面,由于ATP结合位点在CDK蛋白家族中的高度保守,发展选择性的CDK2抑制剂的确很具有挑战性。尽管CDK2的蛋白结晶的解析,为我们研究CDK2抑制剂提供了依据,但是对于CDK2的选择性机制还远远不够。因此,利用计算机模拟,阐明CDK2和配体的选择性机制,对于研制CDK2选择性抑制剂具有根本意义。CDK4在CDK家族中分布最为广泛。CDK2和CDK4的折叠形式的相似度达到了45%,其中,在ATP结合位点,仅仅有4个氨基酸残基的差别。在CDK2中的Phe82、Leu83、Lys89和Gln131,分别对应CDK4中的His95、Val96、Thr102和Glu144。由于CDK2和CDK4的高度相似,因此,报道过的CDK4和CDK2抑制剂也有一定的相似性。研究发现,敲除掉CDK2和CDK4基因,使得胚胎由于心力衰竭而死亡。此外,据报道,CDK4在某些内分泌细胞的增值过程中发挥至关重要的作用。当抑制了CDK4的活性,能够引起胰腺B细胞的减少,进而导致胰岛素缺陷型的糖尿病。所以,选择性的抑制CDK2,而对CDK4不造成影响可能对于发展疗效理想,同时副作用的小的化合物的有效的途径。最近,研究发现,N-phenylpyrimidin-2-amines类化合物对CDK2有高选择性,而对CDK4无明显影响。因此,利用3D-QSAR,同时结合分子对接、MESP计算、Mulliken电荷分析和分子动力学模拟,研究CDK2和CDK4选择性抑制剂。实验结果表明,疏水基团和氢键供体有利于CDK2配体复合物的形成,同时,静电基团和氢键受体有利于CDK4配体复合物的形成。利用3D-QSAR研究CDK2和CDK4与抑制剂作用的不同特点,发现,化合物3A、4B和5B有非常相似的结构,但是这三个化合物对于CDK2的选择性分别是CDK4的5000倍、90倍和9倍。分子对接结果显示,三个化合物在ATP结合口袋中,构象类似于V形。除此之外,选择对CDK2和CDK4抑制活性基本无差别的化合物5B,以及抑制活性最低和化合物化合物26B和27B,计算DFT和MESP。数据显示,MESP分析与3D-QSAR和分子对接的结果一致。另外,Mulliken电荷分析表明,化合物26B和27B的正负电荷分布与3D-QSAR的结果不一致。化合物3A、4B和5B对CDK2有更高的选择性,通过分子动力学模拟和结合自由能的分析,研究CDK2选择性抑制剂的结构特点。同时,将动力学模拟的结果与3D-QSAR得到的结果进行对比分析,进一步进行结构分析。结合自由能的降解分析表明,抑制剂主要靠范德华力与CDK2/CDK4相结合。结合自由能计算结果显示,化合物3A、4B和5B主要通过与Glu8、Ile10、Gly11、Val18、 Ala31、Phe80、Glu81、Phe82、Leu83、Gln85、Asp86、Gln131、Asn132、 Leu134、Ala144和Asp145的相互作用与CDK2相结合。而与CDK4的结合主要通过与Ile12、Gly13、Val20、Ala33、Phe93、Glu94、His95、Va196、Gln98、 Asp99、Leu147、Alal57和Asp158的相互作用。同时发现,Gln85、Asp86和Lys89对CDK2的选择性发挥至关重要的作用。而抑制剂与CDK4的结合,主要是与Glu144和Asn145的静电相互作用。对于化合物3A,与Gln85、Lys89和Asp145的相互作用,对CDK2的选择性至关重要。化合物4B主要靠与Lys89、 Asp86和Asp145的相互作用发挥选择性。化合物5B,主要与CDK4中的Glu144侧链形成氢键相互作用发挥选择性,然而,3A和4B与CDK4并没有该氢键相互作用。细胞周期-蛋白依赖性激酶-7是一种转录激酶,作为CDK家族的特殊成员,在细胞分裂调控和转录调控中具有双重功能。其不仅控制细胞周期来调节CDK激酶的活化,也作为常见转录因子II H (TFIIH)的组成部分参与转录的辅助调节。因此,CDK7的抑制可能导致其它CDK激酶转录和活化的中断,包括CDKl和CDK4,而且进一步导致多种毒性反应的发生。作为CDK家族的一员,CDK7和CDK2具有高度的结构同源性,只有很少的CDK2抑制剂针对CDK7具有超过30倍的选择性抑制作用。因此,深入理解CDK2和CDK7的配体特异性识别机制以及配体-受体之间的相互作用,对于亚型选择性抑制剂的合理设计具有重要意义。最近,2-苯胺-4-(噻唑-5-基)-嘧啶类化合物作为高效CDK2抑制剂对于CDK7具有超过100倍的选择性抑制作用。在本工作中,我们综合运用计算分子对接,EasyMIFS,基于结构的药效团模拟,基于配体的MESP图和分子动力学模拟等技术,希望通过对于CDK2和CDK7选择性结合具有重要作用的配体-残基相互作用进行解释来进一步提高抑制剂的选择性。我们对三个具有相似化学结构的2-苯胺-4-(噻唑-5-基)-嘧啶类化合物,包括CP1, CP2和CP3,分别进行了针对CDK2和CDK7的选择性机制研究。作为CDK2抑制剂,针对CDK7, CP1具有很好的选择性抑制作用(900倍),CP2具有一般的选择性抑制作用(70倍),而CP3作为CDK7抑制剂,对于CDK2具有65倍的选择性抑制作用。首先,我们利用类似甲基探针(CMET)对X-射线共结晶复合物ATP-CDK2和ATP-CDK7 (PDB编号：1JST,1UA2)的分子作用场(MIFs)进行分析,并对靶蛋白的配体结合口袋中一些特定子区域进行了剖析。EasyMIFs结果表明最适合容纳类似甲基探针(CMET)簇区域主要集中在一小块子区域中(Phe80-结合口袋)。该结合口袋周围分布着Ile10, Gly11, Gly13, Val18, Lys33, Val64, Phe80, Glnl31, Asn132, Ala44, Asp145等CDK2氨基酸残基,总的相互作用能为1622.967 kcal·mol-1。而在CDK7的类似甲基探针(CMET)簇分布区域(溶剂展开表面积)中主要分布着Glu20, Thr96, Asp97, Glu99, Val100, Lys139, Pro140, Asn141等氨基酸残基,总的相互作用能为-955.828 kcal·mol-1。因此,我们利用分子结合技术发现抑制剂CP1, CP2和CP3通过氨基噻唑环的疏水作用和范德华力结合在由CDK2氨基酸残基构成的Phe80-结合口袋中。CDK7抑制剂活性最好的抑制剂CP3的哌嗪基团则通过和CDK7氨基酸残基Thr96, Asp97, Val100之间的范德华力和疏水作用一直延伸到配体结合口袋的溶剂接触面。我们也希望通过比较配体的立体和静电特性以及其在CDK2和CDK7结合位点的药效团特征来分析配体的亲和性、选择性。MESP和基于药效团的分析也有利于理解和合理分析CDK2抑制剂CPl的负电荷对于CDK7选择性抑制的重要作用。同样,我们也详细讨论了CP3正电荷对于CDK7选择性的重要作用。通过分析来源于药效团模型的基于结构的化学特征,我们发现MESP突出显示的区域与CDK2活性口袋中关键氨基酸残基Leu83, Asp86, Lys89的作用有直接联系,CDK2关键氨基酸残基Met94和Asp97也有相同结果。另外,CDK7具有疏水性氨基酸残基Val100,而CDK2具有亲水性氨基酸残基Lys89,因此CDK7和CP1、CP2具有更好的相互作用。同时,由于CDK7的疏水性残基Va1100能很好的和CP3的哌嗪环相互作用,CP3具有良好的CDK7抑制活性。而由于CDK2在类似区域存在氨基酸残基Lys89,因此CP3的哌嗪基团无法很好地和CDK2结合。HOMO和LUMO分析也表明化合物CP1具有比CP2和CP3更高的HOMO值,因此CPl能更好地通过给电子和CDK2结合。作为中等选择性化合物,CP2具有更高的LUMO值,表明CP2具有更好的电子接受能力。CPl作为活性最好的化合物,其具有比另外两个抑制剂更高的偶极矩(水相=15.7D,气相=11.52D)。最后,我们利用配体CP1, CP2, CP3和CDK2及CDK7的复合物进行分子动力模拟。相关配体和复合物的结合自由能也通过MM/PBSA和MM/GBSA方法进行了计算。结合自由能的计算和分解结果表明和CDK2的氨基酸残基Glu8, Ile10, Glyll, Val18, Ala31, Phe80, Glu81, Phe82, Leu83, Gln85, Asp86, Lys89, Gln131, Asn132, Leu134, Ala144, Asp 145之间的范德华力和静电作用有利于蛋白和三个抑制剂的结合。而有利于抑制剂和CDK7结合的氨基酸残基包括Ile6, Gly7, Val14, Ala27, Phe79, Asp80, Phe81, Met82, Thr84, Asp85, Val88, Leul32, Alal44, Asp155。结合自由能分解结果显示氨基酸残基Gln85, Lys89, Asp 145对于CDK2选择性抑制具有重要作用。和CDK7氨基酸残基Thr96、Val100的疏水性作用对于CDK7选择性抑制具有重要作用。另外,我们也利用计算机模拟突变对配体-受体相互作用中的重要氨基酸残基的影响进行研究。Q85T-CP1复合物中Gln85突变后导致结合自由能△Gbind(GB)明显下降(14.12 kcal·mol-1)。由于重要氢键的缺失,K89L-CP1复合物中Lys89的突变直接导致结合自由能bind (GB)只有9.12 kcal·mol-1。更重要的是Gln85和Lys89的突变后形成的静电作用不利于配体-蛋白结合(△Gele: 11.23 kcal·mol-1,6.12 kcal·mol-1). D145A-CP1复合物中氨基酸残基Asp145的突变导致结合自由能AGbind(GB) (9.21 kcal·mol-1)和范德华作用能(23.12 kcal·mol-1)的减少。尽管CDK2ATP结合位点的氨基酸残基Asp145在CDK激酶家族中高度保守,但是我们的计算结果显示CDK2氨基酸残基Asp145可能对于受体的配体识别具有重要作用,而CDK7中的相应氨基酸残基Asp155对于配体识别则没有该相同作用。由于蛋白结合口袋非常相似,因此所谓抑制剂的选择性是由其中氨基酸残基的微小空间区别所引起的。通过比较活化位点,我们发现CDK2, CDK4, CDK7之间的关键氨基酸序列区别可能对于针对CDK其它亚型选择性抑制CDK2具有重要作用。CDK2, CDK4, CDK7的ATP结合域高度保守,在其结合位点只有非常少的区别。例如,CDK2在铰链区的氨基酸残基是Leu83,而CDK7在铰链区的氨基酸残基是Va196和Met94。我们通过对CDK2的结合口袋图片分析发现配体3A,4B,5B, CP1, CP2, CP3的嘧啶环可以和CDK2铰链区氨基酸残基Leu83的NH基团形成螯合氢键。CDK4和CDK7结合口袋中也存在相似的情况。CDK2的氨基酸残基Lys89可以和CDK4的氨基酸残基Thr102及CDK7的氨基酸残基Va1100相互叠合,这解释了化合物3A,4B, CP1, CP2的选择性。因为化合物3A,4B, CP1, CP2可以和CDK2氨基酸残基Lys89的侧链胺基基团形成氢键作用,而在其它CDK4和CDK7的配体-蛋白复合物中则没有。更重要的是,当CDK2氨基酸残基Phe82和His84叠合时,在各自蛋白中,CDK2氨基酸残基His84分别被CDK4氨基酸残基Asp97及CDK7氨基酸残基Glu95取代。除此之外,CDK2氨基酸残基Gln85可以和CDK7氨基酸残基Thr96相叠合。在各自蛋白中,CDK4的酸性氨基酸残基Glu144分别被CDK7氨基酸残基Asnl41以及CDK2氨基酸残基Gln131所取代。MMGB/PBSA能量分解结果显示抑制剂5B和CP3的高抑制活性可能是由于抑制剂分别和CDK4氨基酸残基Gln144及CDK7氨基酸残基Asn141形成强相互作用所导致的的。我们通过一系列的分析发现,磺胺基团能提高CDK2抑制剂针对CDK4和CDK7的抑制选择性。以上发现也为CDK2选择性抑制机制的研究提供良好的基础。尽管如此,CDK2中对抑制剂选择性具有重要作用的氨基酸残基仍然需要进一步的研究。由于CDK2选择性抑制剂良好的研究前景,因此,对于CDK2抑制剂的相关研究有利于发现更好、选择性更高、具有类药性的新型CDK2抑制剂。