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长链多不饱和脂肪酸(long chain polyunsaturated fatty acids,LC-PUFAs)对人体有良好生理功能,除了鱼油这种传统来源外,在油料作物中重构LC-PUFAs的合成途径是一种非常有前景的替代来源。在以表达脂连接型去饱和酶为策略的LC-PUFAs代谢工程研究中,去饱和酶中间代谢产物需要在PC库和CoA库之间进行多次转换,导致LC-PUFAs合成的终产物含量较低。LPCAT(属于溶血磷脂酰基转移酶)被推测是在转换过程中起重要作用的酰基转移酶。然而,植物来源的LPCAT报道较少,而且LPCAT对LC-PUFAs合成的影响以及参与PC和CoA库之间脂肪酰基转运的机制尚不清楚。本研究从烟草Nicotiana benthamiana和三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum中克隆LPCAT基因,并在酵母中进行功能验证和底物特异性研究。通过将LPCAT与不同类型脂肪酸去饱和酶和延长酶在酵母中共表达,分析其脂肪酸,CoA及脂质组变化,试图阐明LPCAT对LC-PUFAs合成的中间代谢产物转运及终产物积累的影响机制。主要结果如下:(1)从烟草中克隆到两个溶血磷脂酰基转移酶基因NbLPCAT1和NbLCPAT2,其编码产物均属于MBOAT蛋白家族。LysoPAF敏感实验表明NbLPCAT1和NbLCPAT2都有LPCAT酰基转移酶活性。酵母磷脂分析实验表明:表达NbLPCAT1和NbLPCAT2的重组酵母优先利用16:0-LPC,16:1-LPC和18:1-LPC作为酰基受体;18:2-CoA,18:3-CoA为酰基供体。利用重组酵母微粒体为LPCAT酶源的体外酶活实验表明:NbLPCAT1对LPC及不饱和的C18-CoAs表现出偏好性。NbLPCAT2对LPA表现出的活性比LPC要高,且对18:3-CoA有较好的偏好性。采用RT-PCR方法检测烟草LPCAT基因的表达模式,结果表明:NbLPCAT1和NbLPCAT2在花中的表达水平最高,在其它组织器官中均有不同程度的表达。(2)从富含EPA的三角褐指藻中克隆到一个PtLPCAT基因并验证功能。将NbLPCAT1,NbLPCAT2及PtLPCAT与不同来源的脂肪酸去饱和酶和延长酶在酵母中共表达,这些脂肪酸去饱和酶和延长酶包括:来源于三角褐指藻的脂连接型去饱和酶PtD6,PtD5;来源于小立碗藓的脂肪酸延长酶PSE;来源于青绿藻的CoA型去饱和酶OtD6和细小微胞藻中的CoA型去饱和酶MsD5。构建三种不同类型重组酵母并进行功能验证,三种类型的重组酵母中分别共表达:(a)CoA型去饱和酶和延长酶;(b)脂连接型去饱和酶和延长酶;(c)脂连接型去饱和酶、延长酶和LPCAT。结果表明:(a)类型重组酵母中LC-PUFAs终产物的含量最高,(c)类型重组酵母与(b)类型重组酵母相比,△6去饱和酶中间代谢产物在CoA库中的含量较高,终产物LC-PUFAs的积累量较高,表明LPCAT的表达促进了代谢中间产物的脂肪酰基在PC和CoA之间的转移,在一定程度上解除脂连接型去饱和酶应用于转基因合成LC-PUFAs过程中的代谢瓶颈,提高LC-PUFAs的积累量。(3)不同类型重组酵母脂质组分析表明:(c)类型重组酵母与(b)类型重组酵母相比,表达NbLPCAT1的重组酵母菌株中PCsn-1、sn-2位置上18:2和18:3脂酰基的含量明显上调,表达NbLPCAT2的重组酵母菌株中PCsn-1位置18:2脂酰基含量上调。表明LPCAT的表达能够明显提高△6去饱和酶反应的底物和产物的量;同时进一步证实了NbLPCAT1和NbLPCAT2的底物偏好性,也表明了NbLPCAT1对LPC酰基化的位置没有明显的偏好性。