背景：缺血性脑卒中是一种高发病率和致残率的脑血管疾病，缺血缺氧性神经损伤为其显著特征，主要机制是由脑部血供减少或中断，导致神经细胞发生的一系列缺血缺氧性的病理损害。缺血性脑卒中，根据缺血后血供是否能够及时恢复，分为永久性缺血和缺血再灌注两种类型。但因缺血后恢复血液再灌注，必须在有限的4-6小时内完成，而一般病人缺乏相关专业知识，贻误治疗时机，导致大部分的缺血性脑卒中转变为神经细胞永久缺血缺氧性损伤。　　缺血性脑卒中的主要病理机制包括神经细胞缺氧、缺血后炎症反应、细胞凋亡、细胞坏死、梗死周围去极化等。缺血性脑卒中，尤其是神经细胞永久缺血缺氧性损伤的危害巨大，严重影响人们的健康，但临床治疗的有效性却十分有限。关于缺血缺氧脑损伤的研究主要集中于缺血再灌性损伤，而关于永久缺血缺氧性脑损伤的机制，仍不十分清楚，有待深入研究。近来有研究发现，自噬在炎症反应、循环系统和泌尿系统的缺血性损伤中，扮演促细胞存活的重要角色；但自噬在一些损伤中亦发挥促死亡的作用。因此，关于自噬在缺血缺氧性损伤中的作用，仍然存在巨大的分歧。自噬流是指自噬动态全过程，包括自噬膜生成、包绕待降解的细胞器形成自噬体、自噬体与溶酶体融合，以及溶酶体降解自噬体内容物等环节。任何一个环节出现问题，均可导致自噬失调。以往大部分研究，仅通过常见的自噬标志性蛋白LC3和Beclin-1等的表达情况，评价自噬的激活及发挥的作用，很容易导致对自噬角色的误判。这也许是目前关于自噬在缺血缺氧性神经损伤中的作用，存在巨大分歧的因素之一。而且，目前有关自噬在神经细胞缺血缺氧性损伤中作用的研究，主要集中于缺血后再灌注领域，但对于神经细胞永久缺血缺氧性损伤，自噬的作用及机制，尚有待研究。尤其在自噬如何调节神经细胞缺血缺氧性损伤，究竟发挥着何种作用，尚不明确。　　自噬的调节机制十分复杂，与许多信号通路存在交互作用，如凋亡通路及Notch通路等，而这些通路之间的交互作用，可能会影响自噬的最终结果。Wnt/β-Catenin信号通路以参与调节细胞增殖和胚胎发育而著名，最近的研究发现，在正常条件下自噬及Wnt/β-Catenin信号通路，存在一定的交互作用。但在永久缺血缺氧神经细胞损伤中，Wnt/β-Catenin信号通路在缺血缺氧条件下被激活已有文献报道，但在神经细胞永久性缺血缺氧性损伤中，尤其是Wnt/β-Catenin通路与自噬，是否存在交互作用，尚无相关报道，有待进一步研究。　　目的：　　1、建立OGD模拟的永久缺血缺氧PC12细胞损伤模型，了解神经细胞永久缺血缺氧损伤的机制。　　2、分析自噬流相关蛋白在永久缺血缺氧性神经损伤中的表达，探讨自噬的活化情况，并评价自噬在损伤中发挥的作用。　　3、探讨Wnt/β-Catenin信号通路是否参与神经细胞永久缺血缺氧性损伤，以及自噬和Wnt/β-Catenin信号通路是否存在交互作用及其相互影响的机制。　　方法：　　选用PC12细胞作为研究对象，OGD法（Oxygen Glucose Deprivation）复制神经细胞永久性缺血缺氧模型，应用自噬流作为评价自噬激活以及作用效果的方式。细胞分组：为了检测细胞损伤及自噬激活情况，细胞分为:对照组、OGD组0.5h，2h，6h，12h，24h;为了探讨自噬对OGD方式诱导的细胞保护作用，细胞分为：对照组、RP组（OGD6h+自噬激动剂Rapamycin,）、3-MA组（OGD6h+自噬抑制剂3-MA）、MHY组（OGD6h+溶酶体抑制剂MHY1485）。应用Hoechst33342染色、间接免疫荧光技术，共聚焦显微镜技术，从形态上评价缺血缺氧细胞的具体损伤情况，如细胞凋亡、HIF-1α、COX2的表达变化等，使用MTT比色法、LDH检测法、流式细胞术、Western Blotting对损伤情况量化分析，如细胞生存抑制率、细胞坏死率、凋亡率、HIF-1α、COX2蛋白表达等量化分析。利用免疫荧光实验、激光共聚焦显微技术、透射电子显微术、Western Blotting等实验技术及方式，分析在OGD0.5h、2h、6h、12h和24h自噬流的变化，如LC3、Beclin1、P62等蛋白的表达情况，不同时间自噬体超微结构变化。通过干预自噬活化水平，观察细胞损伤变化，使用自噬激动剂雷帕霉素（Rapamycin）、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyl adenine，3-MA）、溶酶体抑制剂（MHY1485）分别预处理细胞，干预细胞的自噬活化水平，将OGD6h作为短期和长期缺血缺氧的分界点，通过评估HIF-1α及COX2在自噬增强及减弱情况下的变化，评价自噬在缺血缺氧性神经损伤中的作用。探讨经典Wnt/β-Catenin信号通路在神经细胞缺血缺氧性损伤中激活及与自噬的交互作用，利用Western Blotting量化分析Wnt/β-Catenin信号通路的上游蛋白Wnt1、Wnt3a及下游蛋白Dvl2、β-Catenin和靶蛋白C-myc、Cyclin D，在对照组、OGD0.5h、OGD2h、OGD6h、OGD12h和OGD24h的表达情况，评价其在缺血缺氧中的激活情况，以及通过干预改变自噬活性水平，观察Wnt/β-Catenin信号通路以上关键蛋白的表达变化，探讨其与自噬的相互作用及调节机制。　　结果：　　1、OGD诱导的氧化应激反应与OGD时间依赖性的关系。　　OGD诱导的永久性缺血缺氧损伤，导致细胞缺氧相关蛋白HIF-1α、炎症相关蛋白COX2表达随OGD时间延长不断增高，并在OGD12h后与对照组相比显著增高，差异具有统计学意义（p<0.05）。乳酸脱氢酶释放率与OGD时间呈正性依赖关系，OGD12h后，与对照组相比显著提高，差异具有统计学意义（p<0.05）。细胞凋亡率与OGD时间呈正性依赖关系，在OGD6h后与对照组相比显著增高，差异具有统计学意义（p<0.05）。　　2、永久性缺血缺氧引起的自噬改变与OGD时间的关系。　　通过透射电子显微镜检测自噬超微结构，结果显示自噬体随着OGD时间的增加而不断增多。Western blotting结果显示，OGD模拟的永久性缺血缺氧，引起细胞自噬相关性蛋白LC3和Beclin-1表达增高，并且LC3Ⅱ/Ⅰ比值，随OGD时间逐渐增高，OGD6h后显著增高，差异具有统计学意义（p<0.05）。P62蛋白的表达，随OGD时间增加而不断减少，与对照组比较，差异具有统计学意义（p<0.05）。应用溶酶体抑制剂后，LC3Ⅱ/Ⅰ比值较对照组显著增高，差异具有统计学意义（p<0.05）。　　3、OGD诱导的永久性缺血缺氧与自噬的保护作用。　　应用自噬激动剂Rapamycin预处理细胞后，OGD处理细胞6h，LC3表达增强，细胞存活率增加，LDH释放率减少，HIF-1α、COX2表达减少；应用自噬抑制剂3-MA和自噬溶酶体抑制剂MHY预处理细胞，在OGD6h组，LC3表达减少，细胞存活率减少，LDH释放率增加，HIF-1α、COX2表达增加。　　4、Wnt/β-Catenin信号通路与永久缺血缺氧中的自噬。　　Western blotting结果显示，Wnt信号通路上游蛋白Wnt1、Wnt3a的表达，与OGD时间呈正性依赖关系，在OGD12h后显著增加，差异具有统计学意义（p<0.05）。下游蛋白Dvl2、β-Catenin、C-myc和Cyclin D表达，与OGD时间呈负性依赖关系。当应用自噬激动剂后，自噬程度升高，Wnt信号通路上游蛋白Wnt1、Wnt3a的表达增高，下游蛋白Dvl2、β-Catenin、C-myc和Cyclin D表达减少；应用自噬抑制剂3-MA和MHY后，自噬程度降低，Wnt信号通路上游蛋白Wnt1、Wnt3a的表达降低，下游蛋白Dvl2、β-Catenin、C-myc和Cyclin D表达增加。　　结论：　　1、OGD模拟的PC12细胞永久性缺血缺氧损伤，可以引起炎症、缺氧、细胞凋亡和坏死，且这些损伤与OGD时间呈正性依赖关系。　　2、永久缺血缺氧诱导自噬上调，自噬的活化水平与OGD时间呈正性依赖性。　　3、增强自噬，自噬流上调，在OGD诱导的缺血缺氧中，发挥神经保护作用。　　4、Wnt/β-Catenin信号通路在OGD诱导的永久性缺血缺氧中被激活，上游蛋白的表达与OGD时间呈正性依赖，中下游蛋白的表达与OGD时间呈负性依赖。　　5、Wnt/β-Catenin信号通路接受自噬对其的负性调节，二者共同发挥对PC12细胞永久性缺血缺氧损伤的神经保护作用。