目的：支气管哮喘和慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的病理生理过程中都伴有气道炎症反应，但它们的发病机制目前尚未阐明，可能与细胞内钙稳态失衡有关。瞬时受体电位（transient receptorpotential，TRP）基因编码一种通透钙离子（Ca2+）的阳离子通道。TRPC通道是TRP家族重要成员，是目前离子通道领域研究的热点之一。TRPC包括TRPC1-7，研究提示[1,2]，TRPC可能在气道炎症反应中起重要作用，但是TRPC在气道炎症反应中的具体作用及机制目前尚无报道。本课题探究了TRPC在慢性哮喘小鼠肺组织中的表达以及TRPC6在气道上皮细胞炎症反应中的作用及机制，将有助于阐明气道炎症反应的分子机制，为炎症性疾病的临床药物治疗提供新的靶点。　　方法：（1）随机将BALB/c小鼠分成对照组和哮喘组。应用5％卵白蛋白（ovalbumin，OVA）腹腔注射致敏和雾化激发的方法制备小鼠慢性哮喘模型，对照组用生理盐水代替OVA，从气道反应性、支气管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid，BALF）中白细胞计数与分类、肺组织的病理变化三方面证实哮喘模型建立成功。RT-PCR法检测小鼠肺组织TRPC mRNA和免疫组织化学染色法观察肺组织TRPC1、TRPC6与细胞核转录因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）的蛋白表达水平的变化。（2）细胞水平上：①采用RT-PCR、Western blot和免疫荧光化学法检测TRPC6 mRNA和蛋白在人气道上皮细胞株（16HBE）的表达情况。②使用不同剂量的TRPC6高选择性激动剂Hyp9和siRNA以改变TRPC6的功能或表达后，RT-PCR和ELISA法检测16HBE细胞炎症因子IL-8、IL-6 mRNA表达和蛋白分泌情况。③采用1μg/ml的LPS分别作用于培养的16HBE细胞0h、0.5h、2h、6h、12h、24h，应用RT-PCR和Western blot法检测LPS对TRPC6的影响，以及RT-PCR和ELISA法检测炎症因子IL-8、IL-6的mRNA表达和蛋白分泌情况。为了进一步了解TRPC6的表达上调与LPS诱导16HBE细胞炎症反应的关系，本课题使用TRPC6特异性激动剂Hyp9(10μM)和siRNA以改变TRPC6的功能或表达后，应用RT-PCR和ELISA法观察LPS诱导的炎症反应的变化。④用RT-PCR和ELISA法分别检测不同剂量的TLR4特异性抑制剂CLI-095对LPS(1μg/ml)诱导16HBE炎症因子IL-8、IL-6mRNA表达和蛋白分泌的影响；并用RT-PCR、Western blot法分别检测CLI-095(5μM)对LPS(1μg/ml)诱导16HBE细胞TRPC6 mRNA和蛋白表达的影响。⑤LPS(1μg/ml)分别处理16HBE细胞0h、0.5h、2h、6h、12h、24h后，RT-PCR、Western blot、免疫荧光化学法分别检测16HBE细胞NF-κB P65mRNA、蛋白表达与核转位的情况；并用RT-PCR、Western blot、免疫荧光化学法分别检测CLI-095(5μM)对LPS(1μg/ml)诱导16HBE细胞NF-κB P65 mRNA和蛋白表达以及核转位的影响；通过Hyp9(10μM)激活TRPC6通道和siRNA沉默TRPC6基因，应用RT-PCR、Western blot、免疫荧光化学法进一步证实NF-κB介导TRPC6的致炎症作用。　　结果：（1）RT-PCR结果显示，正常小鼠肺组织表达TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC6 mRNA，而慢性哮喘小鼠肺组织TRPC1和TRPC6 mRNA表达显著增高；免疫组化实验进一步观察到，哮喘小鼠肺组织的气道上皮细胞和浸润的炎症细胞中TRPC1、TRPC6和NF-κB P65蛋白表达显著增高，相关性分析显示，TRPC1和TRPC6蛋白的表达水平均与气道反应性、白细胞总数、嗜酸性粒细胞以及NF-κB P65蛋白的表达水平显著相关，NF-κB P65蛋白的表达水平也与气道反应性、白细胞总数以及嗜酸性粒细胞显著相关。（2）细胞水平上，①RT-PCR结果表明，TRPC6 mRNA在16HBE细胞上有表达；Western blot和免疫荧光化学法结果进一步表明，TRPC6蛋白不仅有表达，而且主要定位于细胞膜上。②Hyp9开放TRPC6通道后16HBE细胞的炎症反应明显增强，表现为IL-8和IL-6 mRNA表达和蛋白分泌增加。而基因沉默TRPC6后Hyp9的致炎效应被明显消弱，这更进一步证实了Hyp9的致炎效应是依赖TRPC6而实现的。③LPS处理16HBE细胞后，应用RT-PCR和Western blot检测LPS对TRPC6表达的影响，结果显示，LPS作用2h后TRPC6 mRNA和蛋白表达开始增高，一直持续到24h。与此同时，IL-8 mRNA表达和蛋白分泌6h开始增高，持续到24h；而IL-6 mRNA表达2h开始增高，6h后蛋白分泌才开始增高，亦持续到24h。结果表明，LPS可诱导16HBE细胞发生炎症反应，且这种炎症反应可能与TRPC6的表达增加有关。进一步研究显示，LPS和Hyp9均使16HBE细胞中IL-8和IL-6mRNA表达和蛋白分泌增加；Hyp9能使LPS诱导16HBE细胞炎症反应进一步增强。而TRPC6 siRNA能抑制LPS诱导16HBE细胞炎症反应，进一步证实TRPC6可介导LPS诱导的气道上皮细胞炎症反应。④TLR4的特异性抑制剂CLI-095呈剂量依赖性抑制LPS诱导的细胞因子IL-8和IL-6的mRNA表达和蛋白分泌，其中1μM CLI-095即可发挥显著抑制效应，5μMCLI-095抑制效应更为明显。同时，5μM CLI-095也能抑制LPS诱导的16HBE细胞TRPC6 mRNA和蛋白表达。这些结果表明，LPS是通过TLR4上调TRPC6的表达并引起炎症反应。⑤LPS(1μg/ml)作用16HBE细胞6h后，NF-κB P65 mRNA和蛋白表达开始增高，持续到24h；核转位现象2h后逐渐出现，随着时间的延长，核转位的蛋白越来越多。进一步的实验表明TLR4的抑制剂CLI-095可以抑制LPS诱导的16HBE细胞中NF-κB P65表达上调以及核转位。另外，LPS和Hyp9均使NF-κB P65 mRNA和蛋白表达增加以及蛋白核转位，而LPS和Hyp9的共同作用与单独的LPS或Hyp9相比，NF-κB P65mRNA和蛋白表达以及蛋白核转位现象更为明显。而TRPC6 siRNA则抑制LPS诱导的16HBE细胞NF-κB P65蛋白表达。以上结果表明，NF-κB可介导TLR4/TRPC6通路的致炎症作用。　　结论：（1）正常小鼠肺组织上有TRPC1、TRPC2、TRPC3和TRPC6 mRNA表达；人气道上皮细胞株16HBE上有TRPC6 mRNA和蛋白的表达，而且蛋白主要定位在细胞膜上。（2）慢性哮喘小鼠肺组织的TRPC1和TRPC6 mRNA和蛋白表达水平显著增高，与气道炎症呈显著相关。（3）在细胞水平上证实TLR4/TRPC6/NF-κB信号转导通路介导气道上皮细胞炎症反应。综上所述，本研究发现了 TLR4/TRPC6/NF-κB信号转导通路参与了慢性哮喘气道炎症反应，这不仅为气道炎症性疾病发病机制补充新的内容，也为呼吸道疾病的临床防治提供新的思路。