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目的:基于中医古籍理论,建立“肾痿”及肾痿治疗的科学证据。在前期临床和动物实验基础上,研究肾痿方含药血清对TGF-β1诱导的成纤维细胞及足细胞的作用及机制,进一步证明肾痿方干预肾纤维化的细胞分子作用机制,为开发中药防治慢性肾脏疾病,延缓疾病的进展,减少终末期肾脏疾病发生提供科学依据。方法:1.循证古籍及文献,建立“肾痿”以及肾痿方的理论依据。2.含药血清制备:SD大鼠随机分为空白对照组、肾痿方组、缬沙坦组,肾痿方组大鼠按人体剂量的5、10、20倍剂量给予灌胃;缬沙坦组大鼠按人体剂量的10倍剂量给予灌胃;空白对照组给予同等体积生理盐水灌胃。3.肾痿方含药血清对TGF-β1诱导的NRK-49F细胞的作用及机制研究:体外培养的NRK-49F细胞,以0~100 ng/ml的TGF-β1作用12h、24h、48h、72h,在倒置显微镜下观察细胞形态,用CCK-8法检测细胞增殖状况,确定TGF-β1刺激的最佳剂量和时间。将体外培养的NRK-49F分为正常对照组(10%胎牛血清)、TGF-β1刺激组(TGF-β1 10ng+10%正常大鼠血清)、肾痿方低剂量组(TGF-β110ng+10%成人剂量5倍灌胃后大鼠含药血清)、肾痿方中剂量组(TGF-β1 10ng+10%成人剂量10倍灌胃后大鼠含药血清)、肾痿方高剂量组(TGF-β1 10ng+10%成人剂量20倍灌胃后大鼠含药血清)、缬沙坦含药血清组(TGF-β1 10ng+10%成人剂量10倍灌胃后大鼠含药血清)。倒置相差显微镜观察细胞生长状态,CCK-8法检测各组细胞活性,流式细胞术检测细胞周期变化;免疫荧光、Real-time PCR、Western Blot检测PCNA的变化;通过免疫荧光、Real-time PCR、Western Blot检测细胞表型(ɑ-SMA)及细胞外基质(Fibronectin、Collagen I)的变化。4.肾痿方含药血清对TGF-β1诱导的MPC5细胞的保护作用研究:用10ng/ml的TGF-β1以及各浓度的含药血清刺激MPC5细胞24H、48H、72H后CCK-8法检测各组细胞活性选择合适的刺激时间;免疫荧光检测MPC5细胞ɑ-SMA及上皮细胞标志E-cadherin蛋白的表达情况;Western Blot定量检测细胞表型分子NEPH1、P-cadherin以及ɑ-SMA蛋白的含量。结果:1.文献研究发现,“肾痿”可以定义为肾组织枯萎、萎缩或功能上衰退,甚至废弃不用的一个疾病;可用“肾痿”命名CKD,能够中医药角度反映CKD的动态发展过程。根据病因病机为肾络癥瘕,建立理法中药治疗原则。2.肾痿方含药血清对TGF-β1诱导的NRK-49F细胞的作用及机制研究:(1)肾痿方含药血清对TGF-β1诱导的NRK-49F细胞增殖的作用:倒置相差显微镜下观察,TGF-β1刺激后细胞呈短梭或多角形铺路石样改变,在肾痿方作用后,NRK-49F细胞逐渐变为长梭形;CCK-8细胞活力检测发现,不同浓度肾痿方含药血清及缬沙坦含药血清均能不同程度的降低TGF-β1诱导NRK-49F细胞的增殖,肾痿方含药血清高剂量组具有统计学意义(P?0.05);流式细胞术细胞周期显示,不同浓度的肾痿复方含药血清以及缬沙坦含药血清能明显增加G0/G1期及G2/M期细胞,并减少TGF-β1刺激引起的增多的S期细胞,具有统计学意义(P?0.05);(2)肾痿方含药血清对TGF-β1诱导的NRK-49F细胞表型的作用:TGF-β1刺激后,免疫组化发现α-SMA、Fibronectin、PCNA蛋白的表达明显增加。在不同浓度的肾痿方含药血清及缬沙坦含药血清作用后,抑制α-SMA、Fibronectin、PCNA蛋白表达;Real-time PCR及Western Blot结果显示TGF-β1刺激后α-SMA、Fibronectin、PCNA、Collagen I mRNA及蛋白的表达明显增加,加入不同浓度的肾痿方含药血清及缬沙坦含药血清干预后,呈剂量依赖性地不同程度抑制α-SMA、Fibronectin、PCNA、Collagen I mRNA及蛋白的表达,与TGF-β1比较,具有统计学意义(P<0.05)。(3)肾痿方含药血清对TGF-β1诱导的NRK-49F细胞表型转化的机制研究:Real time RT-PCR结果显示,TGF-β1刺激后,细胞smad3、MAPK10 mRNA的表达明显增加,在不同浓度的肾痿方含药血清及缬沙坦含药血清干预后,呈剂量依赖性抑制smad3、MAPK10 mRNA的表达,与TGF-β1刺激的细胞比较,有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果显示,TGF-β1刺激的细胞p-smad3、JNK-3蛋白表达明显增高,当加入不同浓度的肾痿方含药血清及缬沙坦含药血清干预后,p-smad3、JNK-3蛋白的表达均有不同程度的降低,同缬沙坦含药血清的表达一致,与TGF-β1刺激组比较,有统计学意义(P<0.05)且呈剂量依赖性的变化。3.肾痿方含药血清对TGF-β1诱导的足细胞损伤的作用:(1)将TGF-β1刺激MPC5细胞24H、48H、72H后,细胞的活力较弱,加入不同浓度的含药血清均增加足细胞活力,且在48H时最为明显(P<0.01)。(2)免疫荧光结果显示,TGF-β1刺激MPC5细胞后ɑ-SMA表达明显增加,E-cadherin表达明显降低,加入不同浓度的肾痿方含药血清干预,与缬沙坦含药血清干预一样,ɑ-SMA的表达逐渐减低,E-cadherin的表达增加,抑制细胞表型转化。(3)Western Blot结果也显示,TGF-β1刺激刺激MPC5细胞后P-cadherin、NEPH1蛋白的表达明显降低;ɑ-SMA蛋白表达明显增高,当加入低、中、高不同浓度的肾痿方含药血清后,与缬沙坦含药血清干预一样,P-cadherin、NEPH1蛋白的表达均不同程度的升高;ɑ-SMA蛋白的表达均有不同程度的降低(P<0.01),且呈肾痿方含药血清剂量剂量相关性改变。结论:1.“肾痿”可命名慢性肾脏疾病,能够反映出CKD的动态发展的过程,具有中医理论的证据,肾痿方抗肾纤维化具有中医药理法依据。2.肾痿方能抑制TGF-β1诱导的NRK-49F细胞的增殖作用。肾痿复方能抑制TGF-β1诱导的细胞表型变化和细胞外基质分泌。3.肾痿方通过抑制TGF-β/samd信号通路中磷酸化的smad3和MAPK/JNK通路中的JNK-3,抑制肾间质纤维化,延缓肾纤维化的发生。4.肾痿方能保护TGF-β1诱导的MPC5细胞的活力,抑制MPC5细胞表型的改变。