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研究目的:运动作为一个强度与负荷的刺激因素,极大地增加了心脏的耗氧量,导致心脏绝对或相对的缺氧。间歇大强度运动造成心脏反复短暂的绝对或相对缺血,与IP(ischemic preconditioning,IP)类似,可以诱导心脏产生内源性保护,减轻随后的急性应激造成的心脏损伤,这种运动方式称为运动预适应(exercise preconditioning,EP)。线粒体保护对心脏维持正常的生理状态至关重要,同时又与氧化应激联系紧密。最近研究表明,细胞自噬与线粒体自噬在心肌中发挥重要的线粒体保护作用,且亦与氧化应激联系紧密。本研究以氧化应激、线粒体、自噬三者为中轴线,结合EP的早、晚两个保护期,以力竭运动作为损伤性应激条件,利用自噬阻滞剂渥曼青霉素(wortmannin),并大量应用蛋白线粒体转位关系实验,深入探讨EP诱导的心脏保护中,氧化应激、线粒体、自噬三者之间作用关系,理清心脏线粒体自噬发生机制。为EP心脏保护及机制研究提供新的理论和实验依据。研究方法:200只健康雄性SD大鼠随机分为10组:C组,对照组;EE组,进行一次大强度力竭跑台运动;EEP组,一次大强度间歇的跑台运动建立EP模型,EP后0.5h取材;LEP组,EP建模后24h取材;EEP+EE组,EP后0.5h进行力竭运动;LEP+EE组,EP后24h进行力竭运动;W+EEP组,EP前0.5h腹腔注射渥曼青霉素,EP后0.5取材;W+LEP组,阻滞剂注射如W+EEP组,EP后24h取材;W+EEP+EE组,阻滞剂注射同前,EP后0.5h进行力竭运动;W+LEP+EE组,阻滞剂注射同前,EP后24h进行力竭运动。应用免疫荧光发光法检测大鼠血浆心肌肌钙蛋白I(c Tn I)水平评价心肌损伤;应用苏木素碱性复红苦味酸染色(HBFP staining)观察和评估心肌缺血缺氧程度;应用透射电镜观察心肌超微结构改变,着重观察线粒体和自噬体;应用分光光度法检测大鼠心肌丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、锰超氧化物歧化酶(Mn SOD)和总超氧化物歧化酶活性,以及免疫印迹法检测Mn SOD含量,评价氧化应激程度;应用Phos-tag法检测电压门控阴离子通道1(VDAC1)磷酸化水平,评价线粒体渗透性转换孔道(m PTP)抑制程度;应用线粒体提取结合免疫印迹法检测,细胞色素C(Cyt-c)、自噬受体p62、线粒体自噬蛋白Parkin和Bnip3,评价上述蛋白在胞浆和线粒体的含量变化;应用免疫印迹法检测自噬关键蛋白Beclin1、Bcl-2、LC3I、LC3II水平,结合Beclin1/Bcl-2、LC3II/LC3I比值计算,评价细胞自噬水平和性质;应用组织免疫荧光双标法结合激光共聚焦技术,检测LC3对线粒体内膜蛋白COX4/1、Parkin对线粒体外膜转运酶TOM70、Bnip3对TOM20的转位水平和上述六种蛋白的荧光表达量和分布。通过上述指标深入揭示氧化应激与线粒体自噬在ep诱导心脏保护中的作用和机制。研究结果:(1)与c组相比,ee组心肌损伤标志物血浆ctni水平、hbfp染色缺血缺氧程度均有显著升高,损伤性超微结构改变明显;eep组和lep组无损伤性改变。与ee组相比,eep+ee和lep+ee组,血浆ctni水平降低、缺血缺氧和超微结构改变均有减轻。与eep+ee组相比,w+eep+ee组血浆ctni水平略有降低,但缺血缺氧未见改变且有升高趋势,线粒体肥大明显。与lep+ee组相比,w+lep+ee组血浆ctni和缺血缺氧均有升高,线粒体损伤明显。(2)与c组相比,ee组氧化应激损伤产物mda显著升高,总sod活性降低,氧化应激损伤明显,但h2o2、mnsod活性和含量无变化;eep组和lep组,mnsod、总sod活性均有升高,无mda升高和mnsod含量变化,eep组h2o2显著减低。与ee组相比,eep+ee组mda明显下降,h2o2、总sod活性明显升高;lep+ee组总sod活性升高,但eep+ee组和lep+ee组sod酶活性两数据均分别较之eep组和lep组有明显下降。与eep+ee组相比,w+eep+ee组mda和mnsod活性均明显增高。与lep+ee组相比,w+lep+ee组h2o2显著升高。(3)与c组相比,ee组和eep+ee组,抑制mptp开放的vdac1磷酸化水平显著升高。与ee组相比,lep+ee组、w+eep+ee组、w+lep+ee组vdac1磷酸化水平降低。与eep+ee组相比,w+eep+ee组vdac1磷酸化水平显著降低,线粒体cyt-c泄漏至胞浆显著增高。(4)与c组相比,ee组lc3ii和lc3ii/lc3i比值显著升高;eep组lc3ii/lc3i比值升高;eep+ee组lc3ii和beclin1含量升高提示细胞自噬增强;w+lep组lc3ii、lc3ii/lc3i比值、beclin1/bcl-2比值升高凋亡性自噬水平增高;w+eep+ee组和w+lep+ee组两种比值均升高自噬为凋亡性。与ee组相比,lep+ee组lc3ii和lc3ii/lc3i显著降低,细胞自噬水平较低;w+eep+ee组beclin1升高。(5)与c组相比,ee组lc3转位线粒体cox4/1百分比、线粒体p62降低;eep组lc3转位显著降低;w+lep组cox4/1荧光强度降低。与ee组相比,eep+ee组lc3转位程度、lc3荧光强度、胞浆p62均显著增高;lep+ee组lc3转位程度升高、lc3和cox4/1荧光强度降低;w+eep+ee组lc3转位程度降低,胞浆和线粒体p62均升高;w+lep+ee组lc3转位、线粒体p62升高,lc3、cox4/1荧光强度显著降低。与eep+ee组相比,w+eep+ee组lc3荧光强度显著降低。(6)与c组相比,ee组线粒体parkin、parkin转位tom70程度、parkin和tom70荧光强度显著降低,胞浆和线粒体bnip3、bnip3转位tom20程度、bnip3荧光强度均显著升高,tom20荧光强度无变化;eep组parkin转位、tom70和tom20荧光强度显著降低,胞浆和线粒体bnip3表达量升高;lep组bnip3转位程度、胞浆和线粒体bnip3水平显著增高;w+eep组、w+lep组分别与eep组和lep组在线粒体自噬指标上接近。与ee组相比,eep+ee组线粒体parkin和parkin转位,parkin、TOM70、Bnip3荧光强度均显著升高,胞浆和线粒体Bnip3水平和EE组接近;LEP+EE组线粒体Parkin含量、Parkin转位和TOM70荧光强度升高,Bnip3相关数据均显著下降;W+EEP+EE组Parkin相关数据均有显著升高,但Parkin转位程度显著低于EEP+EE组,胞浆Bnip3和TOM20显著升高;W+LEP+EE组Parkin转位和荧光强度升高。与EEP+EE组相比,W+EEP+EE组Parkin荧光强度显著升高,Bnip3和TOM20荧光强度显著降低。与LEP+EE组相比,W+LEP+EE组Parkin转位显著降低,Bnip3转位、Bnip3和TOM20荧光强度显著升高。研究结论:(1)一次力竭运动造成明显的心肌损伤、缺血缺氧、超微结构损伤以及氧化应激损伤。但线粒体本身损伤并不严重,也无法引起凋亡。可能通过抑制m PTP开放,和增强线粒体分裂以诱导Bnip3依赖的线粒体自噬参与有限的线粒体保护。(2)EP是无损伤的运动方式,可以诱导SOD酶活性升高,并降低H2O2水平,提供心肌适应性。在EP的早期保护时相,m PTP被抑制,H2O2诱导了修复性线粒体自噬水平升高,Parkin和Bnip3均有参与,但Bnip3可能作用更大。在EP的晚期保护时相,Parkin介导的修复性自噬占到了主导作用。(3)自噬阻滞剂wortmannin对EP诱导的线粒体保护产生负面影响,但不会引起EP本身的损伤加剧。在EP早期保护时相,被阻滞的细胞自噬引起细胞一型前凋亡表型上升,使线粒体保护丧失。在EP的晚期保护时相,反而激活了凋亡性自噬,使心肌保护丧失。