白念珠菌是一种常见的机会致病真菌,由于在治疗过程中大量使用抗真菌药物,导致白念珠菌耐药现象日益严重。因此,为了更好地研发新型抗真菌药物,我们需要对白念珠菌的致病机制进行研究。F₁F_o-ATP合酶负责合成细胞内90%以上的三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate,ATP）,它的整体结构在真菌到哺乳动物相对保守,但i/j亚基和k亚基为真菌F₁F_o-ATP合酶所特有。i/j亚基和k亚基极有可能成为抗真菌药物作用的新靶点,所以我们需要明确i/j亚基和k亚基在白念珠菌对宿主的致死性感染过程中的作用。目的通过采用SAT1-Flipper基因敲除策略构建白念珠菌F₁F_o-ATP合酶i/j亚基编码基因ATP18缺失株和k亚基编码基因ATP19缺失株,研究白念珠菌F₁F_o-ATP合酶i亚基和k亚基在小鼠致死性感染中的作用。方法第一部分:采用SAT1-Flipper基因敲除策略构建白念珠菌F₁F_o-ATP合酶i/j亚基编码基因ATP18缺失株和k亚基编码基因ATP19缺失株。第二部分:通过构建小鼠感染模型,对小鼠存活率、器官载菌量、血清生化检测和组织病理学进行分析比较,研究F₁F_o-ATP合酶i/j亚基和k亚基在白念珠菌参与小鼠致死性感染中的作用。第三部分:研究F₁F_o-ATP合酶i/j亚基和k亚基对白念珠菌的生长和线粒体功能的影响。（1）通过体外生长实验测定ATP18缺失株和ATP19缺失株在体外的生长活性。（2）通过非发酵碳源培养基中的生长曲线实验、琼脂点板实验（Spot assay）、细胞内ATP含量测定实验、线粒体膜电位（ΔΨm）测定实验和细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平测定实验,测定ATP18缺失株和ATP19缺失株的线粒体功能。第四部分:通过菌丝形成实验、黏附实验、生物膜形成实验和RT-q PCR,测定ATP18缺失株和ATP19缺失株的菌丝形成能力、黏附能力、生物膜形成能力和致病性相关基因的表达水平,研究F₁F_o-ATP合酶i/j亚基和k亚基对白念珠菌的毒力因子的影响。第五部分:初步探索F₁F_o-ATP合酶i/j亚基在白念珠菌参与小鼠致死性感染中的作用机制。（1）通过Spot assay、Alcian blue-binding实验,测定ATP18缺失株和ATP19缺失株的细胞壁的结构和功能。（2）通过与巨噬细胞相互反应实验,测定ATP18缺失株和ATP19缺失株被小鼠巨噬细胞样细胞系RAW264.7吞噬的能力。（3）通过Spot assay和生长曲线实验,测定ATP18缺失株和ATP19缺失株在模拟巨噬细胞内氧化应激模型中的活性。结果第一部分:PCR结果表明成功构建了ATP18缺失株和ATP19缺失株,并且去除了SAT1筛选标记,RT-q PCR结果表明ATP18基因缺失后i/j亚基随之缺失,ATP19基因缺失后k亚基随之缺失。第二部分:（1）经血液感染小鼠后,感染ATP18缺失株的小鼠在第35天仍有67%存活,而感染亲本株和感染ATP19缺失株的小鼠在第8天全部死亡,ATP18缺失株的毒力弱于亲本株（P<0.05）,ATP19缺失株和亲本株无明显差别。（2）与感染亲本株的小鼠相比,感染ATP18缺失株的小鼠肝、脾、肾在4个时间点的真菌负荷量均显著降低（P<0.05）,感染ATP19缺失株的小鼠肝、脾、肾在4个时间点的真菌负荷量与感染亲本株的小鼠相当（P>0.05）。（3）亲本株和ATP19缺失株对小鼠的肝肾代谢有相同的显著的影响,ATP18缺失株对小鼠的肝肾代谢无显著影响（P<0.05）。（4）组织病理结果表明,感染ATP19缺失株和亲本株的小鼠肾脏有显著的组织学变化,而感染ATP18缺失株的小鼠肾脏无显著组织学改变。与亲本株和ATP19缺失株相比,ATP18缺失株在脑组织中菌丝生长明显减弱。第三部分:（1）体外生长实验结果表明在含可发酵碳源葡萄糖的培养基中,亲本株和ATP18缺失株、ATP19缺失株生长趋势几乎一致,所有菌株都能正常生长,倍增时间的差异无统计学意义（P>0.05）。（2）非发酵碳源培养基中白念珠菌的生长曲线实验结果和Spot assay实验结果表明,在非发酵碳源的培养基中,亲本株和ATP18缺失株、ATP19缺失株的生长趋势几乎一致。（3）细胞内ATP含量测定结果表明,在含可发酵碳源葡萄糖的培养基中和在含有非发酵碳源的培养基中,与亲本株相比,ATP18缺失株和ATP19缺失株细胞内的ATP含量无明显变化（P>0.05）。（4）白念珠菌线粒体膜电位（ΔΨm）和细胞内活性氧（ROS）水平测定结果表明,在含可发酵碳源葡萄糖的培养基中,与亲本株相比,ATP18缺失株和ATP19缺失株线粒体膜电位和细胞内活性氧水平无明显变化（P>0.05）。第四部分:（1）菌丝形成、黏附、生物膜形成实验结果表明,与亲本株相比,ATP18缺失株和ATP19缺失株的菌丝形成能力、黏附能力及生物膜活性无明显变化（P>0.05）。（2）RT-q PCR结果表明,与亲本株相比,ATP18缺失株中致病性相关基因的表达水平显著上调（P<0.05）,而ATP19缺失株中致病性相关基因的表达水平无明显变化（P>0.05）。第五部分:（1）Spot assay结果表明,在37°C,与亲本株和ATP19缺失株相比,ATP18缺失株对CFW的敏感性部分受损。Alcian blue-binding实验结果表明,与白念珠菌亲本株相比,ATP18缺失株和ATP19缺失株细胞壁中甘露聚糖的含量无明显变化（P>0.05）。（2）与巨噬细胞相互反应实验结果表明,亲本株的存活率为（28.68±1.27）%,ATP18缺失株的存活率为（20.11±0.94）%,ATP18缺失株的存活率低于亲本株的存活率（P<0.05）;ATP19缺失株的存活率为（26.96±1.21）%,与亲本株的存活率无差异（P>0.05）;ATP18缺失株对巨噬细胞损伤率比亲本株对巨噬细胞损伤率低26%（P<0.05）;ATP19缺失株对巨噬细胞损伤率与亲本株对巨噬细胞损伤率无差异（P>0.05）。（3）Spot assay和生长曲线实验结果表明,在氧化剂H₂O₂存在时,ATP18缺失株具有明显的生长缺陷（P<0.05）。结论本研究成功地构建了ATP18缺失株和ATP19缺失株,发现编码基因缺失后,F₁F_o-ATP的i/j亚基和k亚基随之缺失,i/j亚基缺失后白念珠菌对小鼠的致病性降低。明确了i/j亚基和k亚基不影响白念珠菌在体外的生长活性、毒力因子和线粒体功能,细胞壁的结构和功能受损、对氧化应激的敏感性增高在i/j亚基缺失后白念珠菌的致病性降低中起着关键作用。本研究的完成将为进一步筛选作用于F₁F_o-ATP合酶的靶向抗真菌药物提供科学依据。