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枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种已被美国FDA认定为生物安全GRAS（Generally regarded as safe）的革兰氏阳性菌。其具有良好的蛋白质分泌能力的优势,并且发酵条件简单,因而被广泛应用于工业和食品酶制剂的生产中。虽然诸多工业、食品酶制剂已经在B.subtilis中实现重组表达,但现有蛋白质表达系统所具有的异源蛋白生产能力还远远不能满足规模化生产的需求。其中启动子元件在基因表达系统中发挥核心作用,而大多数正在B.subtilis中使用的启动子存在活性不高的问题。本论文对B.subtilis中强启动子进行了活性比较、分子改造以及对生产多种重组蛋白中的发酵水平进行了系统研究,并优化了发酵培养基中的关键成分及其配比,实现了纳豆激酶的高效重组分泌表达。本研究具体内容如下:（1）重组枯草芽孢杆菌蛋白质表达载体的构建。首先以编码绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因,构建多种重组蛋白质表达载体,对比分析了启动子PHpaII、PsrfA、Pp43、Pveg和Psigw的活性。结果显示,五种启动子的活性存在很大差异,其中启动子PsrfA活性最高。（2）对强启动子PsrfA进行了理性改造:（a）对启动子上游序列进行系列截断,获得了启动子活性略有提高的精简启动子;（b）将高活性精简启动子的核心区序列突变为保守序列,并进行组合突变,最终得到了活性最高的突变启动子P10,较原始启动子活性提高了150%;（c）对P10启动子中的核糖体结合位点RBS进行了不同起始翻译效率的设计,但启动子活性均有所下降。（d）将上述构建好的表达系统用于氨肽酶的表达,成功实现了氨肽酶的高效表达,改造后的启动子使氨肽酶的表达量提高了360%。（3）枯草芽孢杆菌重组纳豆激酶分泌表达系统的构建。将上述构建好的表达系统用于纳豆激酶的表达,实现了纳豆激酶的分泌表达。同时通过信号肽的选择、启动子的改造和宿主的选择进一步提高了纳豆激酶的分泌表达效率,摇瓶发酵产酶水平达到290FU·m L-1。（4）纳豆激酶5 L发酵罐放大培养工艺的建立。首先优化了培养基组分（氮源、葡萄糖浓度、碳氮比）和培养条件（培养温度、接种量）。确定出最佳发酵条件为:最佳氮源是大豆蛋白胨;葡萄糖浓度为10 g·L-1;最佳碳氮比为1:4;最佳培养温度为37℃;最佳接种量为4%。采用此发酵条件进行5 L罐发酵实验,菌体浓度达到OD600为41.36,纳豆激酶表达量为375.0 FU·m L-1。