微生物产生的环状脂肽结构研究

来源 :华东理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ludongyan900209
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微生物脂肽通常是由脂肪酸和肽链组成的环状结构化合物,由于具有良好的表面活性和生物活性,脂肽在诸多领域有潜在应用。本文从生物表面活性剂产生菌的筛选开始,利用测定表面张力的方法,筛选出了产表面活性剂菌株,该菌株产生的生物表面活性剂被鉴定为脂肽,实验了脂肽提取和分离方法,研究了脂肽的结构和脂肽定量的方法,并进行了脂肽的化学修饰探讨。 利用油滴扩展法和挂片法筛选获得了产生生物表面活性剂的菌株。利用亲水部分的特征反应将提取的生物表面活性剂鉴定为脂肽。 利用液相中氨基酸与茚三酮反应,分析了脂肽中氨基酸的特性,发现脂肽中的氨基酸呈现一定的规律性,反应的平均摩尔吸光系数表现3种模式1)25种不含Pro,Thr或Tyr脂肽中的氨基酸平均摩尔吸光近似为1.94×10-4;2)6种含Thr或Tyr,不含Pro脂肽中的氨基酸平均摩尔吸光近似为1.86×10-4;3)6种含Pro脂肽中的氨基酸平均摩尔吸光近似为1.61×10-4。这种新特性为脂肽的定量分析及脂肽产生菌的评价奠定了基础。 利用电喷雾串联质谱法(ESIMS/MS)和气质联用法(GC-MS)研究了脂肽的化学结构,用串联质谱法结合氨基酸分析,首次揭示环状脂肽质谱中存在双氢转移机制,即当酯和酰胺中醇和胺部分的脂肪链较长时,发生双氢转移重排,酯键断裂时,长链羟基端的两个氢转移到了羧基端,使环状脂肽的C末端氨基酸残基增加17(NH3)或18(OH2),并据此确定了肽链的C端,成功解析了环状脂肽中肽链的氨基酸连接顺序,并预测疏水链为羟基脂肪酸,随后被脂肪链的GC-MS和计算方法所证实。提出的新方法适用于脂肪酸成环的环状脂肽的肽链连接顺序分析,并将对环状脂肽的结构分析产生重要影响;利用气质联用法分析了环状脂肽中的脂肪酸,确定了与肽结合的脂肪酸为β-羟基脂肪酸,计算方法也说明其为羟基脂肪酸。提出以I43/I57为指标判断脂肪酸的分枝情况,其值由大到小的顺序分别预示为异构、正构和反异构的烃链。串联质谱,气质联用及计算方法都说明在环状脂肽中存在羟基脂肪酸,结果互相印证,说明方法可靠。根据研究结果绘出了完整的环状脂肽结构。 脂肽在硅胶板和试管玻璃的固体表面,加热下进行气体-固体表面水解反应,在110℃,2.4mLHCl/L,反应4h,水解完全,在硅胶表面用茚三酮显色后无论斑点净密度或者净密度×斑点面积均与脂肽的量成正比;在试管底部表面用茚三酮液相反应,吸光度与脂肽的量也成正比,据此可对脂肽进行定量测定,大大缩短了脂肽定量分析的时间。 环状脂肽在温度为80℃的0.1mol/L的KOH溶液中水解30min~60min,用ESIMS检测确认完全转化成线形脂肽;环状脂肽和线形脂肽在2.5mL甲醇和025mL37﹪HCl混合溶液中,室温(25℃)反应48h可获得完全甲酯化产物,且有部分甲酯化产物。
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