卵巢癌是所有妇科恶性肿瘤中最主要的致死原因,仅仅在美国,每年就能造成大概14,030例死亡病例,同时还有22,240新发卵巢癌病例。卵巢上皮性癌(Epithelial ovarian cancer,EOC)能够占到卵巢癌的90%,其死亡率高达60%以上。在过去的25年中,EOC总体死亡率只有一小部分得到改善。EOC极高的死亡率一方面归因于该病治疗研究方面缺乏有效的进展,另一方面,很大程度上归因于卵巢癌往往一经诊断就已经达到疾病的晚期阶段,同时会不可避免的出现化疗耐药问题。Hamburger和Salmon首次将卵巢癌描述为一种干细胞疾病,肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)是造成复发的主要因素。CSC理论提出,在肿瘤中仅有一小部分肿瘤细胞可以导致肿瘤发生,这些被定义为“CSC”细胞具有干细胞样特性,如自我复制更新能力(self-renewal,SR),分化能力和致瘤能力(潜在恶性)。因为EOC能够占到卵巢癌的90%以上,其发病原因往往被认为起源于卵巢表面上皮干细胞和输卵管上皮,因此多数的卵巢癌干细胞研究焦点则是EOC的研究。卵巢癌干细胞研究起步较晚,由Bapat et al等人首次在腹水中分离出来,目前常见的分离卵巢癌方法有侧群细胞的分离,卵巢癌干细胞标记蛋白如ALDH1+、CD133+、CD24+、CD44和CD117等。最新研究表明,Lgr5是卵巢表面上皮的一个细胞子集(上皮干细胞)的标志物,可能在未来有助于作为卵巢癌标记物早期检测卵该病。但是迄今为止,现有标记物都不能成功的作为卵巢癌干细胞的标记物,因此卵巢癌缺乏公认的干细胞标记物。近年来,研究人员更倾向于多数恶性肿瘤中,包括卵巢癌在内,存在一种CSC模式,部分文献也称之为CSC层级制度,在这个层级制度中,只有一小部分的肿瘤细胞存在肿瘤干细胞的特性,这一小部分沉默(静止)状态的肿瘤细胞位于层级制度的顶端。传统的化疗模式,最大耐受剂量化疗(maximum tolerated dose chemotherapy,MTD)无法有效的针对这一小部分干性最强的卵巢癌干细胞做出强有力的杀伤,反而更能富集具有干性特征的卵巢癌干细胞,从而造成干细胞增殖活跃,形成新的肿块,造成复发。本研究第一部分我们通过采用免疫组化检测卵巢上皮性癌患者中Lgr5和ALDH1蛋白表达水平,探讨二者之间的相关性,评估其与EOC患者年龄、肿瘤分期,病理分级淋巴转移及对EOC患者预后的影响;第二部分通过卵巢癌细胞系SKOV3建立裸鼠腹腔移植瘤模型,分别给予顺铂低剂量节拍化疗模式和最大可耐受剂量化疗模式,观察不同化疗模式对荷人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠生存状态及裸鼠移植瘤的影响,以给予顺铂化疗后实体瘤研磨形成的细胞悬液为研究对象,利用流式细胞仪分选出的假设具有干细胞属性的CD133+、ALDH1+和ALDH1+CD133+双阳性细胞,探讨MTD法是否能富集卵巢癌干性细胞,;最后部分我们通过Western-Blot方法检测分选后细胞中Lgr5,BCRP,Lef1蛋白含量。通过细胞平板克隆实验和体内致瘤实验进一步验证分选细胞的干细胞特性。探讨不同化疗模式对卵巢癌干细胞层级制度产生调控的机制。第一部分卵巢上皮性癌中Lgr5和ALDH1蛋白的表达及其与临床预后目的:通过免疫组化检测卵巢上皮性癌患者中Lgr5和ALDH1蛋白表达水平,探讨二者之间的相关性,评估其与EOC患者年龄、肿瘤分期,病理分级淋巴转移及对EOC患者预后的影响。方法:以100例石蜡包埋的人体卵巢癌组织标本为研究对象,卵巢良性肿瘤(ovary benign tumors)20例及正常卵巢组织30例作为对照组,通过免疫组化检测卵巢上皮性癌患者中二者蛋白表达水平,探讨Lgr5和ALDH1二者之间的相关性,评估其与EOC患者年龄、肿瘤分期,病理分级淋巴转移及对EOC患者预后的影响。应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线。结果：1临床病理特点本研究包括卵巢上皮性癌病人共计100例,50岁以下的女性患者共计34例,50岁以上的女性患者共计66例。67%的患者被诊断出患有淋巴转移。大多数患者(59%)在位于FIGO分期的Ⅲ、Ⅳ期,高分化占到58%,中分化27%。浆液性癌组织学是最常见的EOC,50%,粘液性癌最不常见,占10%。患者的生存期从9个月到79个月不等,中位生存期为36.89个月。2正常组织、卵巢良性肿瘤及卵巢上皮性癌组织中Lgr5蛋白和ALDH1蛋白的表达免疫组织化学染色法观察发现,Lgr5蛋白主要在卵巢上皮细胞的细胞质内,呈棕色或黄棕色颗粒。100例EOC组织中,93例EOC组织中能检测到Lgr5,其中55例EOC组织强阳性染色,相比较,30例良性卵巢肿瘤组织Lgr5弱阳性表达20/30,占66.7%,正常卵巢组织Lgr5弱阳性表达5/20,占25%。ALDH1蛋白主要在卵巢上皮细胞的细胞质内,呈棕色或黄棕色颗粒。100例EPC组织中,90例EOC组织中能检测到ALDH1,71例EOC组织中高表达ALDH1,相比较,30例良性卵巢肿瘤组织ALDH1弱阳性表达17/30,占56.7%,正常卵巢组织ALDH1弱阳性表达3/20,占15%。46例EOC组织共同高表达Lgr5蛋白和ALDH1蛋白,20例低表达Lgr5蛋白和ALDH1蛋白。EOC卵巢组织Lgr5蛋白和ALDH1蛋白的表达与卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织中二者的表达相比,其差异有统计学意义(均P<0.05)。3 Lgr5和ALDH1的表达与临床病理相关性根据FIGO分期,Lgr5或ALDH1蛋白的表达随着FIGO分期的升高而升高(P=0.009,P=0.029),;根据分化程度,分化程度越低,Lgr5蛋白的表达越高(P=0.034,P=0.005).;Lgr5、ALDH1蛋白的表达与年龄、淋巴转移、组织学类型无统计学差异(P>0.05)。4 EOC中Lgr5和ALDH1蛋白表达的相关性Spearman相关分析结果显示,在EOC组织中,Lgr5的蛋白表达同ALDH1的蛋白表达呈正相关,有统计学意义。(r=0.385,P<0.001)结果见Fig.3)。5 Lgr5蛋白表达与ALDH1蛋白表达与EOC患者生存结果分析Kaplan-Meier分析结果显示,在EOC中,随着Lgr5蛋白和ALDH1蛋白表达的增加,患者存活期缩短。高表达Lgr5蛋白和ALDH1蛋白的患者平均或中位生存期明显小于低表达Lgr5蛋白和ALDH1蛋白的患者生存期。其差异有统计学意义(P=0.001)。结论：1 Lgr5和ALDH1蛋白在卵巢癌肿瘤样本中高度表达;2高表达Lgr5和ALDH1不仅与FIGO分期相关,还同病理分级相关。高表达的ALDH1和LGR5同卵巢癌患者的预后相关。因此,Lgr5和ALDH1对于早期诊断和预测EOC病人的预后有及其重要的意义,后续试验对其可能作为卵巢癌干细胞的标记物进行进一步验证。第二部分不同化疗模式对荷人卵巢癌裸鼠移植瘤中干细胞特性的影响目的:建立裸鼠腹腔移植瘤模型,探讨不同化疗模式对荷人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠生存状态及裸鼠移植瘤的影响;分选出假设具有干细胞属性的CD133+,ALDH1+,ALDH1+CD133+双阳性细胞,探讨不同化疗模式对卵巢上皮性癌CSC样细胞的富集作用,为后续对假定卵巢癌干细胞的鉴定做准备。方法:通过人卵巢癌细胞系SKOV3建立裸鼠腹腔移植瘤模型,分别给予顺铂LDM化疗模式和MTD化疗模式,观察不同化疗模式对荷人卵巢癌细胞SKOV3裸鼠生存状态、化疗副反应和对裸鼠移植瘤的影响。通过对顺铂化疗后实体瘤研磨形成的细胞悬液为研究对象,通过流式细胞分选仪分选出ALDH1+和CD133+,ALDH1+CD133+的,即假设具有干细胞属性的细胞,进一步探讨MTD化疗模式对卵巢癌CSC的富集作用,从而为卵巢癌临床治疗策略提供新的思路。结果:1荷人卵巢癌裸鼠腹腔移植模型建立裸鼠成瘤率:1×107个SKOV3细胞接种于雌性裸鼠腹腔,2周后移植瘤形成;化疗结束后3-5天处死后计算成瘤率为100%。2裸鼠一般状况及化疗副反应评估2.1裸鼠进食量变化裸鼠随机分为三组:即对照组、MTD-DDP组、LDM-DDP组。自化疗开始至化疗结束,共计18天,无裸鼠自然死亡,各组裸鼠一般情况良好,无明显活动减少或动作迟缓;与对照组比较,MTD-DDP组、LDM-DDP组裸鼠进食量减少。化疗第9天,MTD-DDP组、LDM-DDP组裸鼠进食量均低于对照组(P=0.000,P=0.000),MTD-DDP组裸鼠进食量与LDM-DDP比较差异无统计学意义(P=0.877);化疗第18天,MTD-DDP组、LDM-DDP组裸鼠进食量均低于对照组(P=0.000,P=0.000);结论:MTD-DDP组裸鼠进食量与LDM-DDP比较差异无统计学意义(P=0.740)。2.2裸鼠体重变化自化疗第1日至18日,MTD-DDP组和LDM-DDP组裸鼠体重都出现了不同程度下降。化疗第9天,MTD-DDP组、LDM-DDP组裸鼠体重均低于对照组(P=0.001,P=0.000),而LDM-DDP组裸鼠体重与MTD-DDP组比较差异无统计学意义(P=0.458)。化疗第18天,MTD-DDP组、LDM-DDP组裸鼠体重均低于对照组(P=0.000,P=0.000);但LDM-DDP组与MTD-DDP组比较,裸鼠体重差异无统计学意义(P=0.581)。2.3裸鼠腹围变化及腹水形成自化疗开始至化疗结束,共计18天,仅有2只裸鼠有少量腹水形成,均出现在MTD组,MTD-DDP组和LDM-DDP组裸鼠腹围都出现了不同程度升高。化疗第12天,对照组裸鼠腹围均高于LDM-DDP组,比较差异有统计学意义(P=0.025),MTD-DDP组裸鼠腹围与LDM-DDP组比较差异无统计学意义(P=0.246);化疗第15天,MTD-DDP组、LDM-DDP组裸鼠腹围均低于对照组(P=0.017,P=0.000);MTD-DDP组裸鼠腹围同LDM-DDP组比较无统计学差异(P=0.148)。化疗18天,MTD-DDP组、LDM-DDP组裸鼠腹围均低于对照组(P=0.000,P=0.000);MTD-DDP组裸鼠腹围大于LDM-DDP组,比较有统计学差异(P=0.037);2.4裸鼠白细胞变化自化疗开始至化疗结束,MTD-DDP组裸鼠白细胞呈现持续下降趋势。化疗第6日,对照组、MTD-DDP组、LDM-DDP组裸鼠白细胞差异不存在统计学意义(F=0.194,P=0.824)。化疗第12日,MTD-DDP组裸鼠白细胞低于对照组(P=0.018),LDM-DDP组白细胞与对照组比较无统计学差异(P=0.099),MTD-DDP组、LDM-DDP组比较差异无统计学意义(P=0.450);化疗18天,LDM-DDP裸鼠白细胞与对照组比较无统计学差异(P=0.050),MTD-DDP组白细胞低于对照组和LDM-DDP组,比较差异有统计学意义(P=0.000,P=0.036);3腹腔移植瘤生长监测3.1化疗结束后处死裸鼠,对照组移植瘤总重为1.83±0.12g,MTD-DDP组裸鼠移植瘤总重为:1.53±0.20g,LDM-DDP组裸鼠移植瘤最大直径为1.02±0.10g,对照组、MTD-DDP组、LDM-DDP组裸鼠移植瘤总重存在统计学意义(F=32.274,P=0.000)3.2对照组移植瘤最大直径为:1.75±0.24cm,MTD-DDP组裸鼠移植瘤最大直径为:1.60±0.23cm,LDM-DDP组裸鼠移植瘤最大直径为1.33±0.16cm,对照组、MTD-DDP组、LDM-DDP组裸鼠移植瘤最大直径存在统计学意义(F=20.195,P=0.000)4流式细胞分选术检测对照组、MTD-DDP组、LDM-DDP组裸鼠移植瘤原代细胞中CD133+细胞的表达情况流式细胞分选术检测CD133+细胞在LDM-DDP组裸鼠移植瘤原代细胞中所占比率(0.77%±0.01%),明显低于对照组(1.10%±0.13%,P=0.020);CD133+细胞在MTD-DDP组裸鼠移植瘤原代细胞中所占比率(3.17%±0.16%),较对照组显著升高(P=0.000)。经分析,CD133+细胞在对照组裸鼠移植瘤原代细胞中所占比率与其在MTD-DDP组和LDM-DDP组裸鼠移植瘤原代细胞中所占比率存在统计学差异(F=94.441,P=0.000)。提示,MTD-DDP组富集CD133+标记的肿瘤干细胞样细胞,而LDM-DDP组则减少CD133+标记的肿瘤干细胞样细胞的表达。5流式细胞分选术检测对照组、MTD-DDP组、LDM-DDP组裸鼠移植瘤原代细胞中ALDH1+细胞的表达情况流式细胞分选术检测ALDH1+细胞在LDM-DDP组裸鼠移植瘤原代细胞中所占比率(1.83%±0.06%),明显低于对照组(3.10%±0.45%,P=0.000);ALDH1+细胞在MTD-DDP组裸鼠移植瘤原代细胞中所占比率(4.03%±0.10%),较对照组显著升高(P=0.000)。经分析,ALDH1+细胞在对照组裸鼠移植瘤原代细胞中所占比率与其在MTD-DDP组和LDM-DDP组裸鼠移植瘤原代细胞中所占比率存在统计学差异(F=736.691,P=0.000)。提示,MTD-DDP组富集ALDH1+标记的肿瘤干细胞样细胞,而LDM-DDP组则减少肿瘤干细胞样细胞的表达。6流式细胞分选术检测对照组、MTD-DDP组、LDM-DDP组裸鼠移植瘤原代细胞中双标阳性细胞,即ALDH1+CD133+细胞的表达情况流式细胞分选术检测ALDH1+CD133+细胞在LDM-DDP组裸鼠移植瘤原代细胞中所占比率(0.21%±0.03%),明显低于对照组(0.44%±0.01%,P=0.016);ALDH1+CD133+细胞在MTD-DDP组裸鼠移植瘤原代细胞中所占比率(0.65%±0.07%),较对照组显著升高(P=0.006)。经分析,ALDH1+CD133+细胞细胞在对照组裸鼠移植瘤原代细胞中所占比率与其在MTD-DDP组和LDM-DDP组裸鼠移植瘤原代细胞中所占比率存在统计学差异(F=28.543,P=0.001)。提示,MTD-DDP组富集肿瘤干细胞样细胞,而LDM-DDP组则减少肿瘤干细胞样细胞的表达。结论：1 LDP-DDP模式较传统MTD-DDP模式骨髓抑制更轻。2 MTD模式化疗能富集ALDH1+细胞、CD133+细胞及ALDH1+CD133+双阳性肿瘤细胞,而LDM化疗模式能够降低肿瘤中三种阳性细胞比率。相比较传统的MTD化疗模式,LDM化疗模式下不易形成化疗耐药,复发几率较低。第三部分裸鼠移植瘤原代瘤中干细胞的鉴定目的:分别鉴定流式细胞分选后的ALDH1+细胞的肿瘤干细胞样特性,CD133+细胞和ALDH1+CD133+细胞的肿瘤干细胞样特性。方法:本部分实验以第二部分流失细胞分选术分选得到的ALDH1+细胞,CD133+细胞,及ALDH1+CD133+双阳性肿瘤细胞为研究对象,通过体外平板克隆形成实验和裸鼠体内成瘤能力实验对其干性进行验证。同时采用Western blot法进一步测定分选阳性细胞中相关干细胞标志蛋白:Lrg5,LEF-1,BCRP蛋白表达。结果：1 CD133+细胞与CD133-细胞平板克隆形成能力CD133+细胞与CD133-细胞的克隆形成率分别为54.14%±1.95%,3.26%±0.71%,CD133+细胞与CD133-的克隆形成率比较差异有统计学意义(t=73.500,P=0.000)。表明CD133+细胞具有较高的克隆形成能力,提示CD133+细胞具有肿瘤干细胞的特性,可以用于鉴定和分离CSC细胞;2 ALDH1+与ALDH1-细胞平板克隆形成能力ALDH1+细胞与ALDH1-细胞的克隆形成率分别为59.72%±2.16%,5.13%±0.91%,ALDH1+细胞与ALDH1-细胞的克隆形成率比较差异有统计学意义(t=69.773,P=0.000)。表明ALDH1+细胞具有较高的克隆形成能力,提示ALDH1+细胞具有肿瘤干细胞的特性,可以用于鉴定和分离CSC细胞;3 CD133+细胞与CD133-细胞体内成瘤能力将5,000个CD133+细胞和CD133-细胞分别接种裸鼠大腿皮下,6周后CD133+细胞的成瘤率为50%(3/6),CD133-细胞未成瘤(0/6)。将10,000个CD133+细胞和CD133-细胞分别接种裸鼠大腿皮下,6周后CD133+细胞的成瘤率为66.7%(4/6),CD133-细胞未成瘤(0/6)。结果显示,CD133+细胞具有体内成瘤能力,而CD133-细胞不具有体内成瘤能力。因此,进一步显示了CD133+具有肿瘤干细胞的部分特性。4 ALDH1+细胞与ALDH1-细胞体内成瘤能力将5,000个ALDH1+细胞和ALDH1-细胞分别接种裸鼠大腿皮下,6周后ALDH1+细胞的成瘤率为66.7%(4/6),ALDH1-细胞未成瘤(0/6)。将10,000个ALDH1+细胞和ALDH1-细胞分别接种裸鼠大腿皮下,6周后ALDH1+细胞的成瘤率为83.3%(5/6),ALDH1-细胞未成瘤(0/6)。结果显示,ALDH1+细胞具有体内成瘤能力,而ALDH1-细胞不具有体内成瘤能力。因此,进一步显示了ALDH1+具有肿瘤干细胞的部分特性。5 ALDH1+CD133+细胞与ALDH1-CD133-细胞体内成瘤能力将5000个ALDH1+CD133+细胞和ALDH1-CD133-细胞分别接种裸鼠大腿皮下,6周后ALDH1+CD133+细胞的成瘤率为66.7%(4/6),ALDH1-CD133-细胞未成瘤(0/6)。将10000个ALDH1+CD133+细胞和ALDH1-CD133-细胞细胞分别接种裸鼠大腿皮下,6周后ALDH1+CD133+细胞的成瘤率为100%(6/6),ALDH1-CD133-细胞未成瘤(0/6)。结果显示,ALDH1+CD133+双阳性分选细胞具有更强的致瘤能力,同样具有肿瘤干细胞的部分特性。6 Lgr5、BCRP和LEF-1在ALDH1+细胞与ALDH1-细胞中的表达情况通过Western blot方法检测Lgr5在ALDH1+细胞中高表达,而在ALDH1-细胞中低表达,表达灰度分析MOD值为0.61±0.17,025±0.13(P=0.000);BCRP在ALDH1+细胞中高表达,而在ALDH1-细胞中低表达,表达灰度分析MOD值为0.57±0.17,0.23±0.11(P=0.000);LEF-1在ALDH1+细胞中高表达,而在ALDH1-细胞中低表达。表达灰度分析MOD值为0.44±0.18,0.20±0.18(P=0.000)。7 Lgr5、BCRP和LEF-1在CD133+细胞与CD133-细胞中的表达情况通过Western blot方法检测Lgr5在CD133+细胞中高表达,而在CD133-细胞中低表达,表达灰度分析MOD值为0.55±0.25,021±0.17(P=0.001);BCRP在CD133+细胞中高表达,而在CD133-细胞中低表达,表达灰度分析MOD值为0.48±0.21,0.20±0.11(P=0.000);LEF-1在CD133+细胞中高表达,而在CD133-细胞中低表达。表达灰度分析MOD值为0.41±0.21,0.21±0.13(P=0.000)。8 Lgr5、BCRP和LEF-1在ALDH1+CD133+细胞与ALDH1-CD133-细胞中的表达情况通过Western blot方法检测Lgr5在ALDH1+CD133+细胞中高表达,而ALDH1-CD133-细胞中低表达,表达灰度分析MOD值为0.61±0.28,014±0.01(P=0.000);BCRP在ALDH1+CD133+细胞中高表达,而ALDH1-CD133-细胞中低表达,表达灰度分析MOD值为0.60±0.18,0.11±0.12(P=0.000);LEF-1在ALDH1+CD133+细胞中高表达,而在ALDH1-CD133-细胞中低表达。表达灰度分析MOD值为0.47±0.15,0.18±0.12(P=0.000)。9 Lgr5、BCRP和LEF-1在ALDH1+CD133+细胞与ALDH1-CD133-细胞中的表达情况通过Western blot方法检测Lgr5在ALDH1+细胞和ALDH1+CD133+细胞表达无统计学差异(P=0.880);在CD133+细胞和ALDH1+CD133+细胞表达无统计学差异(P=0.140);BCRP在ALDH1+细胞和ALDH1+CD133+细胞表达无统计学差异(P=0.190);在CD133+细胞表达低于+CD133+细胞,表达有统计学差异(P=0.002);LEF-1在ALDH1+细胞和ALDH1+CD133+细胞表达无统计学差异(P=0.097);在CD133+细胞表达低于在ALDH1+CD133+细胞,表达有统计学差异(P=0.013)。结论：1经流式细胞分选得到的裸鼠移植瘤原代细胞CD133+,ALDH1+ALDH1+CD133+细胞细胞确实具有肿瘤干细胞特性,符合肿瘤干细胞假说。2 Western Blot结果显示:Lgr5、LEF-1和BCRP在卵巢癌干细胞中均呈现高表达。