论文部分内容阅读
研究背景与目的:据统计,2013年结直肠癌在世界恶性肿瘤发病率中居第三位。全球每年新增结直肠癌患者120万人左右,约有60.87万患者死于此病。由于饮食结构的改变,人口老龄化及人口基数大等原因,我国结直肠癌发病率和死亡例数却分别占全世界发病和死亡总例数的18.6%和20.1%,均居第一位。虽然近年来在结直肠癌的诊疗方面取得了很大的进步,但5年生存率仍不理想。大量数据表明早期诊断和防治复发转移是提高结直肠癌生存率最有效的方法。而传统的分子标志物对于结直肠癌的早期诊断的敏感性和特异性有限。因此寻找新的分子标记物及治疗靶点已成为结直肠癌研究的亟待解决的问题。长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,LncRNAs)是一类来自基因组非编码区,无蛋白编码功能,长度大于200nt的长链RNA。它们大部分是经RNAPⅡ转录并通过可变剪接而产生,广泛存在于细胞内,其种类、结构及功能多样。由于LncRNAs具有组织特异性与时空特异性,可通过对染色体修饰、转录及转录后水平、表观遗传、细胞周期及细胞凋亡等多层面的调控影响肿瘤的发生发展。目前已成为近年来肿瘤学研究的热点。但它们中仅有极少部分作用于肿瘤的分子机制被阐明,大多数的机制尚不明确。深入研究它们的生物学行为,不仅加深了我们对肿瘤发生发展机制的理解,有望为肿瘤的早期诊断、转移风险的预测寻找新的更可靠的分子标志物,更能为放化疗提供新的靶点。本实验将lncRNARP1在结肠癌细胞中差异性表达,观察其对细胞生物学特性的影响并初步验证其分子机制。研究方法:1.qRT-PCR检测在5株人结肠癌细胞和人正常结肠上皮细胞NCM460中LncRNA RP1-506.5(简称RP1)的表达水平,以同样的方法检测13对结肠癌组织及癌旁组织中RP1的表达水平。2.构建过表达RP1的质粒及对照组空载质粒,构建沉默RP1表达的siRNA及其阴性对照组siRNA,运用瞬时转染上调和沉默结肠癌细胞RP1的表达,探讨RP1对该细胞增殖能力的影响。通过qRT-PCR检测细胞RP1的表达,以验证转染效率是否可靠。3.通过MTS实验、平板克隆形成实验、活细胞工作站实时成像检测RP1对结肠癌细胞增殖能力的影响。4.通过蛋白印迹实验检测RP1对细胞周期蛋白P21、CDK6、CDK4、CDK2、CyclinD3的表达量的影响,初步验证RP1影响结肠癌进展的作用机制。结果:1.qRT-PCR检测RP1的原始表达量发现5株人结肠癌细胞中RP1的表达量均高于人正常结肠细胞NCM460。我们从中选取表达量相对较低的HCT116细胞株,通过上调和沉默其RP1的表达量,观察RP1对结肠癌细胞增殖能力的影响。2.qRT-PCR检测过表达质粒、siRNA的瞬转效率。瞬转过表达质粒的HCT116细胞(HCT116-RP1)较对照组细胞(HCT116-NC)的RP1表达量升高,差异极显著(P<0.01)。瞬转siRNA-1的HCT116细胞(HCT116-Tsi)较对照组(HCT116-Nsi)RP1的表达量下降(P<0.01)。结果表明本实验所构建的过表达质粒、siRNA瞬转效率可靠。3.MTS实验结果显示:RP1过表达组(HCT116-RP1)的增殖能力明显强于对照组(HCT116-NC)(P<0.01)。沉默RP1表达组(HCT116-Tsi)的增殖能力较对照组(HCT116-Nsi)减弱,于第6天开始差异有统计学意义(P<0.05)。在正常结肠上皮细胞NCM460中过表达RP1,MTS结果显示:实验组(NCM460-RP1)与对照组(NCM460-NC)增殖能力差异不明显,无统计学意义(P>0.05)。平板克隆形成实验,活细胞工作站实时成像与MTS实验结果一致。表明:RP1促进结肠癌细胞增殖,而对正常结肠上皮细胞的增殖能力无明显影响。4.蛋白印记实验显示:在HCT116中过表达RP1时,P21的表达水平较对照组明显降低,CDK6的表达升高,CyclinD1的表达升高;而沉默HCT116细胞中RP1的表达时,P21的表达水平较对照组明显升高,CDK6的表达明显降低,CyclinD1的表达降低;而两种处理下CyclinD3、CDK2、CDK4的表达水平差异不明显。结论:1.RP1在结肠癌细胞及结肠癌组织中高表达。2.RP1过表达促进结肠癌细胞增殖能力,沉默RP1表达抑制结肠癌细胞增殖能力。3.RP1通过调控周期蛋白促进结肠癌细胞增殖。