猪促卵泡素(pFSH)是由猪垂体前叶合成分泌的糖蛋白促性腺激素,由α和β亚基组成。FSH在雌性和雄性动物性腺发育中起着决定性作用,是卵泡发育和成熟的关键。在家畜繁殖管理中,pFSH主要应用于诱导卵泡发育。由于生产效率低、半衰期短、活性不稳定等原因,pFSH在家畜繁殖管理中的应用受到限制。毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统具有产量高,纯化方式简单等优点,已广泛应用于重组蛋白的工业生产。但是pFSH在毕赤酵母的重组表达却始终面临着效率低的瓶颈,仍难以实现大规模的工业化生产。本研究旨在利用一系列分子策略,并通过优化发酵条件,提高pFSH在毕赤酵母中的分泌和表达效率。在分子策略方面,本实验分别探讨了菌株筛选、密码子优化、融合蛋白表达等对pFSH重组效率的影响。结果表明,与Muts表型菌株KM71(在甲醇培养液中生长缓慢)相比,pFSH在Mut+表型菌株GS115(在甲醇培养液中快速生长)中的表达量能够提高96%,提示GS115更适合pFSH的表达。接下来,本实验以pFSH的主要活性亚基pFSHβ为模板,探讨密码子优化和融合标签对pFSH重组蛋白表达的影响。结果表明,通过调整密码子识别效率、RNA二级结构及mRNA自由能,pFSHβ蛋白表达水平分别提高143%和22%,并初步确认密码子适应指数(CAI)大于0.8和G+C含量大于40%的条件下,pFSHβ表达效率更高。为了进一步提高融合蛋白的产量,本实验比较了不同融合标签、融合方向和融合蛋白间的连接序列对pFSHβ表达量的影响。结果显示,融合蛋白HSA-pFSHβ在毕赤酵母中的产量明显地高于蛋白pFSHβ或SUMO-pFSHβ。另外,改变HSA与pFSHβ的融合方向或者二者之间的连接序列,并不能进一步提高融合蛋白的产量。通过分析胞内蛋白,本实验发现大量重组蛋白仍残留在胞内,不能有效地被分泌到胞外,且重组蛋白在C端发生了降解。为了减少HSA-pFSHβ的降解或提高其分泌效率,本实验尝试了YPS1基因(编码的蛋白能够从C端切割碱性氨基酸)缺失性菌株或更换信号肽。结果表明,敲除YPS1基因能够减少上清中降解片段的产生,HSA或MSP信号肽能有效地将HSA-pFSHβ蛋白分泌到胞外,但是YPS1基因缺失或更换信号肽均不能进一步提高HSA-pFSHβ的胞外产量。为了验证重组蛋白的生物学活性,本实验构建了同时表达HSA-pFSHα和HSA-pFSHβ蛋白的H3-3菌株,并在H3-3菌株基础上,摸索HSA-pFSH蛋白表达的最适pH值、甲醇浓度及在高密度发酵条件下的产量。结果表明,摇瓶水平上HSA-pFSH蛋白表达的最优pH值和甲醇浓度分别在5.0-6.0和1.5-2%之间,且上清中的重组蛋白经纯化后产量可以达到40.8 mg/l;高密度发酵条件下HSA-pFSH的产量可以达到6g/l的水平,但是大量蛋白发生了降解。接下来本研究构建了稳定表达猪FSHR的HEK293细胞系(HEK293-FSHR),并通过胞内cAMP的变化来检测HSA-pFSH的生物学活性。结果显示,重组HSA-pFSH蛋白可以有效地刺激HEK293-FSHR细胞中cAMP的合成,提示重组HSA-pFSH具有生物学活性。此外,在猪卵母细胞体外成熟实验中,HSA-pFSH可以显著地刺激卵丘卵母细胞(COCs)扩张,同样证实其较好的生物学活性。另外,本实验探究了不同抗氧化剂及共表达分子伴侣对HSA-pFSHp分泌效率及产量的影响。结果表明,添加抗氧化剂A可以明显地提高HSA-pFSHβ蛋白分泌效率,而且其作用效果可能与分子伴侣或囊泡转运有关。其他抗氧化剂并没有类似的效果,提示抗氧化剂A提高重组效率的机制可能并不依赖其抗氧化活性。另外,本实验发现添加抗氧化剂A与共表达分子伴侣PDI、ERO1或BiP具有协同作用,能够将胞外HSA-pFSHβ的产量提高4-15倍。综上所述,本实验结果表明,经过一系列的分子策略和培养条件优化,重组HSA-pFSH蛋白在毕赤酵母中的分泌表达量提高15倍,为大规模重组表达pFSH提供有价值的参考。