研究背景作为最为常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤,恶性胶质瘤(世界卫生组织中枢神经系统肿瘤分级：Ⅲ级及Ⅳ级)呈浸润性生长,伴有活跃血管新生,恶性程度高,患者预后很差。尽管过去几十年中对其基础研究及临床治疗领域均取得长足进步,但新诊断胶质母细胞瘤(GBM,世界卫生组织WHO分级：级)患者中位生存期仅为14.6个月,间变性星型细胞瘤患者(世界卫生组织WHO分级：Ⅲ级)的中位生存期也只有2～3年。通过启动/增强机体特异性抗肿瘤免疫应答,针对胶质母细胞瘤患者开展的多项临床试验均发现可延长患者无病生存期与总体生存期,免疫疗法在恶性胶质瘤治疗中展现出广阔前景。然而,由于胶质瘤伴随的显著免疫抑制效应,例如肿瘤特异性抗原表达缺失、免疫检测点分子过表达、免疫抑制性细胞因子分泌、效应性淋巴细胞失能、调节性T淋巴细胞(Treg)及M2型巨噬细胞／小胶质细胞募集及诱导、免疫抑制性因子积聚等,机体抗肿瘤免疫应答被显著抑制,甚至反向促进肿瘤生长。腺苷是一种重要的免疫抑制性分子。促炎性三磷酸腺苷(ATP)可由应激或受损细胞释放至胞外,迅速细胞表面表达的胞外三磷酸二磷酸水解酶(ENTPD1/CD39)水解为单磷酸腺苷(AMP),并继而由胞外5’-核苷酸酶(NT5E/CD73)进一步水解生成腺苷。腺苷脱氨酶(ADA)则发挥负向调控效应,水解灭活腺苷。因此,胞外酶CD39-CD73-ADA级联反应共同调控腺苷水平稳定,从而维持生理情况下的免疫稳态。然而,在恶性肿瘤、自身免疫性疾病等特定病理条件下,这一平衡被打破,大量腺苷积聚并与激动免疫细胞腺苷受体A2aR,活化Gs蛋白,升高胞内cAMP水平,启动一系列下游信号通路,诱导免疫抑制效应,包括T细胞扩增受限、Th1/Th2平衡偏倚、调节性T淋巴细胞诱导、巨噬细胞活化抑制等。因此,在肿瘤治疗中,胞外酶CD39-CD73-腺苷能信号通路被认为具有巨大转化医学潜力。然而,这一通路诱导免疫抑制的具体机制尚不明确,例如,尽管肿瘤细胞来源CD73在肿瘤形成、转移、免疫抑制等方面的重要性得到了验证,然而他人和我们的前期结果均提示胶质瘤细胞在表达CD73的同时伴有CD39表达缺失。另一方面,鼠类CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Tregs)表面存在CD39与CD73共表达,并协同作用诱导免疫抑制,但人CD4+CD39+T细胞几乎检测不到CD73膜表达与活性。本课题利用多种技术手段对胶质瘤细胞与浸润CD4+T细胞胞外酶表型与功能分别进行了检测。根据这两类细胞截然相反的胞外酶表型与功能,我们发现CD73+胶质瘤细胞与浸润CD4+CD39+T淋巴细胞协同作用,在胶质瘤微环境中共同诱导局部腺苷能免疫抑制。这一机制的阐明可为恶性胶质瘤的治疗提供新的靶点。第一部分：胶质瘤胞外酶表达检测胶质瘤细胞是胶质瘤组织的最主要组成细胞,也是胶质瘤致病性的关键因素。此前文献报道胶质瘤细胞存在胞外5’-核苷酸酶(NT5E/CD73)表达及其酶活性,但并未检测到相应胞外三磷酸二磷酸水解酶(ENTPD1/CD39)表达与酶活性。与此同时,胶质瘤肿瘤干细胞胞外酶表达情况此前亦未见相关报道。因此,本课题首先对常见胶质瘤肿瘤细胞系、肿瘤干细胞以及手术切除恶性胶质瘤组织胞外酶CD39/CD73表达情况进行了一系列检测与分析。1.1胶质瘤细胞胞外酶基因表达检测半定量逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)及定量逆转录-多聚酶链式反应(qRT-PCR)检测显示,胶质瘤细胞系U-87MG、T98G与U-251高表达胞外5’-核营酸酶(CD73),但胞外三磷酸二磷酸水解酶(CD39)表达很低甚至缺失。不同细胞系间CD73表达水平并不一致,在检测的三种细胞中,U-87MG细胞CD73表达最高,T98G最低。1.2胶质瘤细胞胞外酶表型检测三种胶质瘤细胞系的流式细胞术胞外酶膜表型检测结果与转录水平相一致,即胶质瘤细胞呈CD39-CD73+表型。其中U-87MG与U-251细胞CD73表达阳性率均近100%,T98G最低。相比U-251细胞,U-87MG胶质瘤细胞CD73表达水平更高。1.3胶质瘤肿瘤干细胞胞外酶表型分析胶质瘤肿瘤干细胞已发现在胶质瘤相关免疫抑制中发挥关键作用,但此前对肿瘤干细胞胞外酶表型未见报道。通过对11种不同胶质瘤干细胞胞外酶CD39/CD73表达情况进行流式检测后,我们首次报道其中8个胶质瘤肿瘤干细胞系(72.7%)中检测到CD73膜表达,仅有1个细胞系呈CD39阳性率(9.1%)。1.4恶性胶质瘤组织胞外酶表达分析为明确实际恶性胶质瘤肿瘤组织中胞外酶CD39/CD73表达模式,我们使用免疫组织化学法检测了19例恶性胶质瘤手术切除组织(16例胶质母细胞瘤及3例间变性星型细胞瘤),染色结果显示,CD73阳性率为89.5%(17/19),而CD39阳性率仅为21.1%(4/19)。上述结果验证了我们的体外细胞检测结果。综上所述,胶质瘤细胞高表达CD73,但CD39表达近乎缺失。由于CD39是胞外腺苷水解级联反应限速酶,因此胶质瘤细胞呈腺苷代谢缺陷性表型。第二部分：胶质瘤浸润CD4+T淋巴细胞腺苷代谢相关胞外酶表型检测2.1胶质瘤浸润CD4+T淋巴细胞CD39/CD73表型检测尽管胶质瘤浸润CD4+T淋巴细胞在胶质瘤组织中所占比例很低,但这一细胞群体密切参与并介导胶质瘤相关免疫抑制。为研究浸润CD4+T淋巴细胞在腺苷能信号通路中发挥的作用,我们以健康人外周CD4+T淋巴细胞对照组,对新诊断恶性胶质瘤患者外周血与肿瘤浸润CD4+T淋巴细胞胞外酶表型分别进行了分离与检测。经检测发现,相比健康对照组,新诊断恶性胶质瘤患者外周血CD4+T淋巴细胞CD39/CD73表达未见显著性差异。然而在胶质瘤微环境中,肿瘤浸润CD4+T淋巴细胞CD39表达显著上调(患者外周血CD4+T细胞CD39阳性率8.0±5.7%，浸润CD4+T细胞CD39阳性率61.8+19.3%,P<0.05)。与此同时,浸润CD4+T细胞中CD73表达水平相比外周血并未相应上调。此前尚无对人体实体瘤浸润淋巴细胞CD39/CD73表型的报道,我们的发现尚属首次。2.2人CD4+CD39+T淋巴细胞CD26/CD73表型分析由于胶质瘤浸润CD4+T淋巴细胞高表达CD39低表达CD73,胞外酶表达并不完整,我们进一步检测了人CD4+CD39+T细胞亚群的胞外酶表型特征。腺苷脱氨酶(ADA)是腺苷能信号通路的关键负向调控酶,而我们发现人CD4+CD39+T细胞低表达CD26-ADA复合物,提示这一亚群有利于腺苷积累。然而,CD73在CD4+CD39+T细胞表面阳性率仅为11.7+2.3%,甚至低于CD4+CD39+T细胞的23.5+12.8%。由于ATP水解与腺苷生成依赖CD39与CD73的协同作用,人CD4+CD39+T细胞低表达CD73提示其核苷酸水解功能缺陷。2.3人CD4+Foxp3+调节性T细胞CD73表型分析胶质瘤中Foxp3+调节性T细胞浸润程度与肿瘤分级正相关,这与我们发现的浸润CD39+T细胞中调节性T细胞标志物CD39表达上调相吻合。然而我们的结果发现人恶性胶质瘤浸润CD4+T细胞CD73表达未发生上调,且CD4+CD39+T细胞低表达CD73,鉴于鼠类CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞表面特异性共表达CD39与CD73,我们进一步检测了人CD4+Foxp3+调节性T细胞CD73表达情况。本研究发现,无论固有调节性T细胞(nTregs),或是诱导性调节性T细胞(iTregs),均高表达CD39,但CD73表达很低,表明调节性T细胞胞外酶表达类型在不同物种间可能存在种属差异。至此,我们明确并首次报道恶性胶质瘤浸润CD4+CD39+T (?)细胞呈胞外酶CD73缺陷性表型。第三部分：胶质瘤细胞及CD4+T淋巴细胞不同亚群胞外酶活性分析基于上述结果,我胶质瘤细胞呈CD39-CD73+表型,而浸润CD4+T细胞呈互补的CD39highCD73low表型。在这一部分,我们分别检测了胶质瘤细胞与CD4+CD39+T淋巴细胞胞外酶活性,以证实胞外酶表型与功能的相关性,并验证不同来源CD39与CD73间亦可存在协同作用。3.1胶质瘤细胞胞外酶活性分析在此前所检测的3种胶质瘤细胞中，U-87MG与T98G细胞分别具有最高与最低CD73表达水平,因此我们选择这两种代表性细胞系检测胞外酶活性。与表型一致,胶质瘤细胞存在高度胞外5’-核苷酸酶活性,能够水解外源性AMP, CD73选择性抑制剂APCP则能够拮抗CD73介导的磷酸根生成。相比T98G细胞,U-87MG细胞5’-核苷酸酶活性显著较高,这与CD73表达水平相一致。受检胶质瘤细胞未检测到显著三磷酸二磷酸水解酶活性。3.2CD4+T淋巴细胞胞外酶活性分析为分析人CD4+CD39+T细胞胞外酶活性,我们首先自健康人外周血单个核细胞(PBMCs)使用免疫磁珠法分选CD4+T淋巴细胞,并进一步根据CD39表达情况流式细胞术分选出CD4+CD39+T细胞与CD4+CD39-T细胞亚群。经检测发现,新鲜分选CD4+CD39+T细胞存在显著胞外三磷酸二磷酸水解酶活性,并这一活性可被CD39选择性抑制剂ARL67156抑制。然而这一细胞无法水解外源性AMP,提示人CD4+CD39+T细胞亚群5’-核苷酸酶活性缺失,上述结果与其表型相符。三磷酸二磷酸水解酶与5’-核苷酸酶活性在CD4+CD39-T细胞中均缺失。3.3不同来源CD39与CD73存在协同作用上述表型与功能检测结果提示CD73阳性胶质瘤细胞与浸润CD39阳性CD4+淋巴细胞之间可能存在协同作用,弥补自身胞外酶功能缺陷,共同诱导局部核苷酸水解与腺苷积聚。为排除胶质瘤细胞其他因素的影响,我们使用提取自Crotalus atrox毒液的可溶性5’-核苷酸酶模拟CD73酶活性。将可溶性5’-核苷酸酶加入CD4+CD39+T细胞后,水解外源性ATP产生的磷酸浓度增加,这一协同作用可被CD73选择性抑制剂APCP拮抗。这一证据证明CD39与CD73之间存在协同作用,完整胞外酶级联反应链,诱导免疫抑制性腺苷生成。第四部分：CD39与CD73协同作用对CD4+T细胞扩增的影响鉴于不同来源的CD39与CD73间的协同作用已得到验证,且胶质瘤细胞与CD4+CD39+分别呈CD39与CD73缺陷状态,故而本研究对这两种细胞间是否存在协同作用,从而共同抑制应答性CD4+CD39-T细胞扩增的影响进行了进一步检测。为消除肿瘤细胞增殖对T细胞分裂可能造成的营养剥夺效应,胶质瘤细胞预先被丝裂霉素C (mitomycin C)处理,以抑制其有丝分裂。与此前报道相一致,羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)标记的CD4+CD39-应答性T淋巴细胞扩增可被自体CD4+CD39+T淋巴细胞抑制,抑制百分比为28.5+4.0%,而胶质瘤细胞U-87MG或T98G单独存在时均未发现对CD4+CD39-应答性T淋巴细胞扩增构成影响。当共培养体系中存在U-87MG胶质瘤细胞时,CD4+CD39+T淋巴细胞对应答性T淋巴细胞扩增的抑制效应更为显著(47.8+3.5%对28.5+4.0%)。CD39抑制剂ARL67156或CD73抑制剂APCP均可阻断这种协同效应,提示CD39+T淋巴细胞与CD73+胶质瘤细胞互补诱导免疫抑制。与之类似,CD73低表达的T98G胶质瘤细胞亦可诱导类似免疫抑制效应,但程度显著不及高表达CD73的U-87MG细胞。应答性T淋巴细胞扩增抑制还可被腺苷受体A2aR亚型拮抗剂SCH58261所消除,提示腺苷受体A2aR参与介导腺苷能免疫抑制信号通路。第五部分：胞外酶表达情况与胶质母细胞瘤患者预后大样本分析人类肿瘤基因组图谱(the Cancer Genome Atlas, TCGA)通过应用基因组分析技术,特别是采用大规模的基因组测序,将人类肿瘤基因组进行检测,并进行系统分析,旨在找到所有致癌和抑癌基因的微小变异,了解癌细胞发生、发展的机制,在此基础上取得新的诊断和治疗方法,以及预防癌症的策略。根据TCGA数据库人类胶质母细胞瘤数据集,本研究对大样本肿瘤组织中CD39/CD73信使RNA (mRNA)表达情况与胶质母细胞瘤患者预后相关性进行了统计学分析。在对超过300例患者信息进行分析后发现,肿瘤组织CD73转录水平表达下调的胶质母细胞瘤患者中位无病生存期自未下调患者的6.7个月延长至10.4个月,具有显著性差异。此外,CD73转录水平表达下调患者的中位总体生存期也有一定程度延长(14.0个月延长至15.3个月)。上述证据不仅在大样本范围内确认CD73表达于恶性胶质瘤组织中,且高度提示靶向抑制肿瘤CD73具有高度转化医学潜力。结论恶性胶质瘤细胞高表达胞外酶CD73,但低表达CD39；相比外周血,胶质瘤浸润CD4+T淋巴细胞CD39表达显著上调,但CD73表达无显著差异；人CD4+T淋巴细胞极少存在CD39与CD73共表达：恶性胶质瘤细胞与人CD4+CD39+T淋巴细胞分别存在与其表型相符的胞外酶功能障碍,但不同细胞来源的CD39与C73酶活性间存在互补；胶质瘤来源CD73能够与CD4+T淋巴细胞来源CD39协同作用,共同诱导腺苷介导的应答性T细胞扩增抑制；胶质瘤组织CD73表达与患者预后相关,提示CD73可能成为胶质瘤免疫治疗新靶点。综上所述,本研究发现包括肿瘤干细胞在内的胶质瘤肿瘤细胞高表达CD73,但CD39表达缺失。与之相反,我们首次报道恶性胶质瘤浸润CD4+T淋巴细胞呈CD39highCD73low表型。尽管胶质瘤细胞与浸润CD4+CD39+T淋巴细胞分别存在胞外酶表达与功能缺陷,但两类细胞间存在协作互补,可共同诱导腺苷产生及其下游免疫抑制效应,抑制CD4+CD39-应答性T细胞扩增。这一机制的阐明不仅是对胶质瘤局部免疫抑制机制已有认识的补充与完善,且肿瘤组织CD73表达下调有利于患者预后的发现高度提示这一胞外酶CD39-CD73腺苷免疫抑制通路在恶性胶质瘤治疗中具有极大转化医学潜力。