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在母猪卵泡生长发育过程中,99%以上的卵泡选择性消失,称为“闭锁”,只有少数卵泡在卵泡发育过程中排卵。排卵总数是由基因调控的,称为“排卵率”,是农场动物,特别是母猪繁殖效率的一个重要参数。排卵率是决定生育后代数量的主要限制因素。颗粒细胞的凋亡影响卵泡闭锁和生殖,颗粒细胞凋亡的机制可能是卵泡闭锁研究的关键,并受miRNA和某些基因的表达调节。白藜芦醇参与的调控途径包括通过抑制细胞增殖途径和细胞周期蛋白依赖性激酶(cdks)抑制细胞增殖,促进细胞分化,通过激活线粒体依赖性或非依赖性途径诱导凋亡细胞死亡等,然而其在猪卵巢颗粒细胞上的研究还并不完善。颗粒细胞的凋亡不仅受miRNA的调节,也受某些基因的调节,比如先前已经使用各种动物模型研究了 THBS1在卵泡功能或闭锁中的作用,但是THBS1在pGCs中的生物学功能及相关调控机制还并不清楚。本研究以猪卵泡颗粒细胞为研究对象,首先分析了白藜芦醇在猪卵巢颗粒细胞上的功能,包括其对猪卵泡颗粒细胞形态,增殖,细胞周期以及激素等的影响;另外研究了白藜芦醇与miR-222之间的调控关系。并在此基础上进一步探索了 miR-222对猪卵巢颗粒细胞凋亡的影响以及作用机制。本文进行了如下试验:(1)白藜芦醇对pGCs潜在的生物学功能以及与miR-222的调控关系;(2)miR-222对pGCs潜在的生物学功能以及对pGCs凋亡的分子调控机制分析。(3)干扰THBS1基因的表达对pGCs潜在的生物学功能以及对pGCs凋亡的分子调控机制分析。(4)miR-222对THBS1基因表达调控机制的分析以上研究主要获得如下结果:(1)使用白藜芦醇以不同的浓度(0 μmol/L,10μmol/L,25 μmol/L,50 μmol/L,75μμmol/L,100 μmol/L)处理pGCs,随着白藜芦醇添加浓度的增加,发现pGCs的形态在浓度达到100μmol/L时而发生改变;pGCs的增殖可以被白藜芦醇抑制,且以浓度依赖的方式被抑制;但是pGCs中的雌激素水平并没有显著变化。用不同浓度的白藜芦醇处理pGCs后,G0/G1期细胞百分比增加,S期和G2/M期细胞细胞百分比的减少,在G0/G1期停滞的细胞数目最多。同时,发现随着白藜芦醇浓度的增加,周期相关基因CyclinB和CyclinD的mRNA水平呈剂量依赖的方式降低;p21的mRNA水平整体上调。另外,白藜芦醇可以调控miR-222的表达,并随着白藜芦醇的浓度增加呈现先下降后上升的趋势;miR-222抑制白藜芦醇75 μmol/L浓度时诱导的pGCs的凋亡。(2)miR-222模拟物可以促进细胞数量增加并抑制pGCs的凋亡;增加抗细胞凋亡BCL-2基因的表达水平并降低促凋亡caspase-3基因的表达水平;增加pGCs中的雌激素的水平。miR-222抑制物抑制颗粒细胞数量的增加并促进颗粒细胞凋亡;降低BCL-2的表达水平。(3)转染THBS1-siRNA GCs 48h后,用流式细胞仪检测了干扰THBS1基因对GCs凋亡的影响,发现转染THBS1-siRNA的pGCs凋亡率显著低于转染NC模拟物的pGCs。RT-PCR结果显示干扰THBS1基因后能够降低促凋亡基因caspase-3的表达水平,而对抗凋亡基因BCL-2的表达水平没有显著影响。但是,干扰THBS1基因后pGCs中的雌激素水平下调;pGC细胞活力降低。干扰THBS1基因能够抑制白藜芦醇75 μmol/L浓度时诱导的pGCs的凋亡。(4)miR-222能够与THBS1基因3’UTR区特异位点结合,调控THBS1基因mRNA和蛋白的表达,THBS1作为miR-222的靶基因,对miR-222调节pGCs凋亡具有直接影响。